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1、湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性 内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。当待 测 DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的 改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也 会随之改变，借此可作出分析诊断。如：（ 2005 湖北 3） 镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生 了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是A.解旋酶 B.DNA 连接酶C.限制性内切酶D.RNA 聚合酶解析：根据 碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针 的方法。 采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片 段与正常人的DNA 分子片段单链放在
2、一起，互补的碱基序 列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位 则仍然是两条游离的单链。解 旋酶的作用是DNA 分子在复 制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达 到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶 都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种 特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基 本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶 的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而 RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成 mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题 的。 必须使用的酶就是限制性
3、内切酶，故选 C。根据DNA 分 子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起， 形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离 的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将 其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。2008 天津 30-下图为人 -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图， -表示基因的不同功能区。 从本题看出基因的单链的编 码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链， 但 是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子 对应的单链部分所含有的上百个核苷酸， mRNA 根本没有对应互补的部分，这
4、就说明它们之间相差很大也能 够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血 症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基 因转录的 mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成 杂合链吗？应该是肯定可以 ,如果这样来检测，那镰刀型细 胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到 区别，无法鉴别。所以必须采用限制性内切酶分析法来检 测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰 刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两 短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰 刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的 限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长
5、段，在用以上 三段对应的已标记的mRNA 进行 杂交（此过程可以不用任 何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳， 如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是 突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利 用相关知识点命题的请看如下高考试题。2007 江苏 38 单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型 细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传 病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰 刀型细胞 贫血症患者的基因型为bb。 有一对夫妇被检测出均为该致病 基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都 进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交
6、诊断和结果示 意图。 (1) 从图中可见， 该基因突变是由于碱基对改变 (或 A 变成 T) 引起的。 巧合的是， 这个位点的突变使得原来正常 基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3 个酶切 位点，突变基因上只有2 个酶切位点，经限制酶切割后， 凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带 谱，正常基因显示2 条，突变基因显示1 条。 (2)DNA 或 RNA 分子探针要用放射性同位素 (或荧光分子等 ) 等标记。 利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列 ( ACGTGTT )，写出作为探针的核糖核苷酸序 列 UGCACAA 。 (3) 根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎
7、 儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4 次妊娠的胎 儿 -lII-4 中基因型 BB 的个体是一 l 和一 4 ，Bb 的 个体是一 3 ，bb 的个 体是 一 2 。 解析 :比较基因 B 和和突变后的基因b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基 因一条链某一位点上的碱基A 突变成 b 基因一条链某一位 点上的碱基T （实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改 变）。据图观察，正常基因B 经限制酶切割后，凝胶电泳分 裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条， 而突变后的基因b 经限制酶切割后，与探针杂交后可显示 出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿-1 -4 的基因型时，
8、可以这样认为：基因型Bb 的个体同时带有B 基因和 b 基因，所以其应同时含有与B 基因对应的二条带 谱，与 b 基因对应的一条带谱（这也可以从-1 和 -2 得 到验证）。 符合这个条件的仅有-3。 同理，基因型为 BB 的 个体应仅有与B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是-1 和 -4。bb 的个体是只能是含有与b 基因相对应的一条带 谱，为-2。作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以 可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核 苷酸 链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明 确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当 DNA 链上的 碱基是 A 时，作探针用的RNA 链
9、上的碱基应为U。 通过如 上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特 异性 DNA 探针来检测的方法， 即是酶切和核酸分子杂交两 种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的 时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界 环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广 泛，如：在柯萨奇B 组病毒B1-B6 型检测及分型中的应用 - 利用 GCG 软件对柯萨奇B1-B6 型病毒 cDNA 全序列进 行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该 方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题 也是屡屡出现 , 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程 中应多加重视。-ACGT GTT- -ACGAGTT- 正常的 血红蛋白基因B 突变的血红蛋白基因b 图注 :限制酶酶切 点 突变碱基探针杂交区域带谱 I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电 泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱