《2019-2020学年高中生物新同步沪科版选修1学案：第6章 第2节 DNA片段的扩增——PCR技术 Word版含解析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2019-2020学年高中生物新同步沪科版选修1学案：第6章 第2节 DNA片段的扩增——PCR技术 Word版含解析.pdf（7页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第二节 第二节 DNA 片段的扩增片段的扩增PCR 技术技术 一、DNA 在细胞内的复制 1所需的酶：解旋酶、DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶等。 2引物：一段 RNA。 3原料：四种脱氧核苷酸。 4原则：碱基互补配对原则。 二、PCR 技术的过程 1 把 PCR 缓冲液、 DNA 模板、 一对引物、 四种脱氧核苷酸、 DNA 聚合酶、 Mg2 等成分加入微量离心管中。 2把离心管置于 95 的高温中，使 DNA 碱基对之间的氢键断裂，DNA 双 链拆开成为两条单链。 3 将离心管置于55 的环境中， 使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。 4再将离心管转置于 72 的环境中，在 DNA 聚
2、合酶的催化下，游离的脱氧 核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。这样高温变性、低 温复性和中温延伸三个步骤便构成了 PCR 过程的一个循环。 三、实验操作 1准备 (1)为了避免外源 DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的离心管、吸头、缓 冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 (2)如果没有 PCR 仪， 可以设置 3 个恒温水浴锅， 温度分别为 95 、 55 和 72 ，然后按要求在 3 个水浴锅中来回转移 PCR 的微量离心管即可。 2扩增 3检测 利用 DNA 在 260 nm 的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。 即 DNA 的 浓度(g/mL)稀释倍数
3、。 A260nm 0.02 一、DNA 复制(体内)与 PCR 技术(体外) 体内复制PCR 技术 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能 量，部分解开 加热至 95 左右，双链 全部解开，不需解旋酶 引物一小段 RNA单链 DNA 分子片段 合成子链 在引物基础上，一条链连续合 成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端 开始，都是连续合成，控 制温度 72 特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增 Taq DNA 聚合酶 不需要需要 循环次数受生物体自身控制30 多次 不 同 点 温度体内温和条件高温(可变) 相同点 需提供 DNA 复制的模板 四种脱氧核苷酸为原料 都需要一定的缓冲溶液 子链
4、延伸的方向都是从 5端到 3端 (1)解旋酶的作用是使 DNA 两条链的氢键断开，而 DNA 聚合酶与 DNA 连接 酶都是催化形成磷酸二酯键。 (2)DNA 聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的 3端上，需要模板，而 DNA 连接酶连接的是两条 DNA 片段的缺口，不需要模板。 二、PCR 技术的实验操作程序 1PCR 扩增前的准备 2PCR 扩增循环 3检测 PCR 扩增效果 4绘图(DNA 的紫外线吸收曲线图) PCR 技术的原理及过 程 如图为某一次循环的产物，请据 图回答问题。 (1)PCR 一般要经历 30 多次循环，每次循环可分为_、_、 _3 个步骤。 (2)PCR 技术与
5、细胞内 DNA 复制在解旋时原理不同 ： 细胞内复制利用_ 使双链间氢键断裂，而 PCR 技术利用_原理，使双链氢键断裂。以引物为 标识，可判断出此产物最早为第_次循环的产物。 (3)PCR 反应中，如果以引物为标识，共有几种 DNA 分子产生？你能把它们 画出来吗？ 审题导析 解析 (1)PCR 的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸 3 步，从 第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。 (2)DNA 分子在细胞内复制时。 在解旋酶的作用下使氢键断裂， 而在体外， DNA 在 95 的高温中变性。即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此 分离的单链又会重新结合形成双
6、链。 在 PCR 反应中， 以引物为标记， 第一次循环时， 以加入的 DNA 为模板， 两条 DNA 链可分别由引物和引物与其结合并在 DNA 聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子 DNA 中只有 1 种引物；从第二次循环开 始，上次产生的 DNA 分子又可作为模板参与反应，所以会出现 DNA 分子两端均 含引物的情况，如图所示： 因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。 (3)产生的 DNA 分子有 3 种：只含引物的，只含引物的和既含引物又含 引物的。 答案 (1)高温变性 低温复性 中温延伸 (2)解旋酶 热变性 一 (3)共有 3 种，分别为： 当 PCR 反应体系的温度由变性后快速
7、冷却到 50 左右时，引物与模板结合， 一般不考虑解开的两个 DNA 模板链的重新结合，原因：a.模板 DNA 比引物长得 多而且复杂的多，不易重新结合；b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链 间的碰撞；c.加入的引物量足够大而模板链数量少。 PCR 技术是把 DNA 片段在体外酶的作用下， 合成许许多多相同片段的一种方 法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或 DNA 分子片段，它的基本 过程如图所示： 注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物含 2030 个脱氧核 苷酸，并分别与两条单链 DNA 结合，其作用是引导合成 DNA 子链。 (1)PCR 技术的原理是模拟
8、生物体内_的过程。 (2)PCR 扩增过程中需要对 DNA 片段进行高温处理，其目的是_，此 过程在生物体内称为_，需_酶的参与。 (3)假如引物都用 3H 标记，从理论上计算，所得 DNA 分子中含有3H 标记的 占_。 (4)假定 DNA 片段含 200 对脱氧核苷酸，经 3 次扩增，从理论上计算需要 _个游离脱氧核苷酸。 解析 (1)(2)由图可知高温变性的过程就是 DNA 在高温条件下解旋的过程， 在生物体内则需要酶的催化才能进行。低温复性时两条 DNA 分子都需要引物。 (3)每次低温复性时，引物都与两条单链 DNA 结合，进而形成双链 DNA，所 以所得 DNA 中均含 3H。扩增
9、 3 次一共形成了 8 个子代 DNA 片段，需游离的脱氧 核苷酸数为(81)4002 800 个。 答案 (1)DNA 复制 (2)使 DNA 两条链彼此分开 解旋 解旋 (3)100% (4)2 800 1PCR 技术最突出的优点是( ) A原理简单 B原料易找 C所用 DNA 聚合酶具有耐热性 D快速、高效、灵活、易于操作 D PCR 技术实际上是在体外模拟细胞内的 DNA 复制过程， 形成大量特异性 的 DNA 片段。原理复杂、原料多样，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易 于操作正是 PCR 技术的突出优点。 2下列哪种温度下 DNA 会发生复性( ) A95 B55 C37.5
10、D72 B DNA 在 95 环境下解旋，复性温度为 55 ，在 72 时，DNA 链得以 延伸。 3TaqDNA 聚合酶由水栖高温菌分离而得。其生长适宜温度为 7075 。 回答下列问题： (1)用 TaqDNA 聚合酶代替一般的 DNA 聚合酶是使 PCR 普及应用的关键。因 为普通的酶不能耐受94 时使双链DNA变性的温度。 因此， 每次循环都要_， TaqDNA 聚合酶的发现和应用解决了上述问题，提高了 PCR 的效率，使 PCR 技术 趋向_。 (2)PCR 反应扩增 DNA 片段时，_决定了扩增片段的长短。 (3)若加入的模板是 2 个相同的 DNA 分子，如果只想要“拷贝”这 2
11、 个长长的 DNA 分子中“特定区间” ，在其他条件均理想时，经过 30 次循环，理论上能获得 _个“特定区间”片段。 解析 普通 DNA 聚合酶在 DNA 变性温度条件下失活，因此，必须循环一 次更换一次新酶才能保证 DNA 复制顺利进行， 而 TaqDNA 聚合酶在 94 的 DNA 变性条件下不会失活，故可以反复利用，解决了 PCR 聚合酶只能从两引物的 3端 开始连接脱氧核苷酸，是 DNA 片段延伸的起始位点，两引物的 5端决定了扩增产 物 DNA 片段终点。每个 DNA 分子中“特定区间”经过 30 次 PCR 反应后理论上 可获得 230个“特定区间” ，其中有 2 个位于 DNA 分子的 2 条链上，不是“特定区 间” 片段。 故2个DNA经30次PCR循环后获得的 “特定区间” 片段理论上有2302 4(个)。 答案 (1)加入新酶 自动化 (2)2 个引物 (3)23024