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1、专题2 2 微生物的培养与应用 课题1 1 微生物的实验室培养 1.说出培养基的种类、营养要素、配制原则。 2.能根据消毒、灭菌的原理,进行无菌操作。 3.能用牛肉膏蛋白胨培养基纯化大肠杆菌。 一二三四 一、培养基 1.概念 人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的 营养基质,该基质称为培养基。 2.种类 根据物理性质不同可将培养基分为液体培养基和固体培养基。 3.营养构成 各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外,还要满 足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 一二三四 二、无菌技术 1.获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵,具体操作如下。 (1)对实验
2、操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 (3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附 近进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相 接触。 2.消毒:指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部 的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。日常生活中常用的方法有煮 沸消毒法、巴氏消毒法和化学药剂消毒法。 此外,实验室里还用紫外线或化学药物进行消毒。 一二三四 3.灭菌:指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括 芽孢和孢子)。常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 一二三四 三
3、、大肠杆菌的纯化培养 1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 (1)步骤:计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 (2)倒平板的过程 在火焰旁右手拿锥形瓶,左手拔出棉塞。 右手拿锥形瓶,使锥形瓶的瓶口迅速通过酒精灯火焰。 左手将培养皿打开一条缝隙,右手将培养基倒入培养皿,左手 立刻盖上皿盖。 待平板冷却凝固后,将平板倒过来放置,使皿盖在下、皿底在 上。 一二三四 2.纯化大肠杆菌 微生物接种最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 (1)平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 (2)稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同 稀释度的菌
4、液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。 两种接种方法都是为了将聚集在一起的微生物分离,得到由一个 细胞繁殖而来的肉眼可见的单个菌落。 一二三四 四、菌种的保存 1.对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法。 2.对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。 一二三四五六 一、培养基的成分与微生物生长所需的营养 微生物细胞的化学组成与其他生物的大体相同,也是由C、H、O、 N、P、S以及其他元素组成,其中C、H、O、N占细胞干重的90% 以上,这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合 物。这些化合物可以归纳成碳源、氮源、水、无机盐和特殊营养 物质五大类。因而,虽然培养不同
5、微生物的具体培养基配方不同, 但一般都要有这几类物质。下表为碳源、氮源与特殊营养物质的 相关知识。 一二三四五六 一二三四五六 一二三四五六 特别提醒(1)不同微生物对营养的需求不同,所以培养不同的微生 物所需要的营养可能不同。 (2)对异养微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是 氮源。 (3)培养微生物时营养物质要协调。营养物质过少不能满足微生 物的营养需求,过多会对微生物的生长有抑制作用。 (4)之所以要补充特殊营养物质,是由于微生物缺乏合成这些物质 所需的酶或合成能力有限。 (5)在提供营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对 pH以及氧气等的需求。如培养霉菌时需将培养
6、基的pH调至酸性, 培养细菌时需将pH调至中性或微碱性,培养厌氧微生物时则需要 提供无氧的条件。 一二三四五六 二、配制培养基的原则 1.目的要明确。要根据培养的微生物的种类、培养的目的等选 择原料。如自养微生物可以用无机物作碳源、氮源。 2.营养要协调。配制培养基时,必须注意各种营养物质的浓度和 比例。如蔗糖是多种微生物的主要营养物质,但高浓度的蔗糖会抑 制微生物的生长。其中碳源和氮源的比最为重要。例如,碳氮比为 4 1时,谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少;碳氮比为3 1 时,菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。 3.pH要适宜。不同微生物适宜生长的pH范围不同。 一二三四五六 三、消毒与
7、灭菌的比较 二者的主要区别:消毒只能杀死一部分微生物,灭菌杀死的是所 有微生物。 特别提醒无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微 生物污染外,还能有效避免操作者自身被微生物感染。 一二三四五六 四、几种消毒和灭菌方法及其适用范围 一二三四五六 一二三四五六 规律总结用巴氏消毒法对牛奶进行消毒,可以杀死牛奶中的微生 物,而牛奶的营养成分不会被破坏;紫外线照射30 min可以杀死物体 表面或空气中的微生物,在照射前,适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液 等消毒液,可以加强消毒效果;对于那些培养基中需要、但加热会 分解的化合物,如尿素、NaHCO3,不能用高压蒸汽灭菌法灭菌,只能 将其配成溶液,使用特
8、定的器材单独过滤灭菌。 一二三四五六 五、倒平板的注意事项 1.培养基灭菌后,需要冷却到50 左右时,才能用来倒平板。可 以用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不 烫手时,就可以进行倒平板了。 2.倒平板前,要将装有培养基的锥形瓶瓶口通过酒精灯的火焰,以 防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后,要将平板倒置。平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠, 凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,可以防止皿盖 上的水珠落入培养基,造成污染。 4.倒平板过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位,最好不要继续用这个平板培养微生物,因为空气中的微生物可 能在皿盖与皿底之间的培
9、养基上滋生。 一二三四五六 六、微生物的纯化 1.纯化大肠杆菌 (1)原理:在培养基上将细菌稀释分散成单个细胞,使其长成单个 的菌落,这个菌落就是纯化的细菌菌落。 一二三四五六 一二三四五六 一二三四五六 2.纯化大肠杆菌操作过程中的注意事项 (1)平板划线法中多次灼烧接种环进行灭菌的目的不同。 一二三四五六 (2)稀释涂布平板法操作比较复杂,且各个细节均需保证无菌操作, 应特别注意以下几点。 酒精灯与培养皿的距离要适宜。 移液管管头不要接触其他任何物体。 移液管要在酒精灯火焰周围使用。 涂布器末端浸在体积分数为70%的酒精中,取出时,要让多余的 酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在
10、酒精灯火焰上 引燃,注意防火。 题型一题型二题型三题型四 【例题1】 下列关于微生物的营养的说法,正确的是 ( ) A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B.凡是碳源都能提供能量 C.除水以外的无机物仅提供无机盐 D.无机氮源也可能提供能量 解析:对一些微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又 是氮源。CO2是光能自养型细菌的碳源,但不能提供能量。CO2和 N2是无机物,它们分别是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的 氮源是无机氮源氨,同时氨也为硝化细菌提供进行化能合成作用的 能量。 答案:D 题型一题型二题型三题型四 反思领悟对一部分微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳 源,又
11、是氮源;有机碳源能提供能量,无机碳源不能提供能量;有的无 机物也可提供碳源、氮源和能源。 题型一题型二题型三题型四 题型二 无菌操作相关技术 【例题2】 细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦 拭、火焰灼烧等几种不同的处理,这些处理依次用于杀灭哪些部位 的微生物?( ) A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环 C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅 解析:高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备,通常用于培养基的灭 菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底 地灭菌,适用于微生物的接种工具,如接种环。 答案:C 题型一题型二题型三题型四 反思领悟微生物培养过程中的无菌
12、操作包括消毒和灭菌两大类, 它们分别有不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手 进行清洁和消毒;对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等 器具进行灭菌。 题型一题型二题型三题型四 题型三 培养基的配制 【例题3】 下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的说法,错误 的是( ) A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B.将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C.待培养基冷却至50 左右时进行倒平板 D.待平板冷却凝固510 min 后将平板倒过来放置 解析:制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、 灭菌、倒平板。牛肉膏容易吸潮,所以将称好的牛肉膏连同称量纸 一同放入烧杯中
13、,当牛肉膏溶化并与称量纸分离后,用玻璃棒取出 称量纸。待培养基冷却至50 左右时,进行倒平板。平板冷却凝 固后还需倒置。 答案:A 题型一题型二题型三题型四 反思领悟固体培养基的制作步骤是计算、称量、溶化、灭菌、 倒平板,任何两个步骤之间次序都不能颠倒。 题型一题型二题型三题型四 题型四 微生物培养过程 【例题4】 回答下列有关微生物培养的问题。 (1)在大肠杆菌培养过程中,除考虑营养条件外,还要考虑 、 和渗透压等条件。大肠杆菌由于具有体积小、 结构简单、变异类型容易选择、 、 等优点,常用作遗传学研究的实验材料。 (2)在微生物培养操作过程中,为防止杂菌污染,需对培养基和培 养皿进行 (填
14、“消毒”或“灭菌”);操作者的双手需要进 行清洗和 (填“消毒”或“灭菌”);静止空气中的细菌可 用紫外线杀灭,其原因是紫外线能使蛋白质变性,还能 。 题型一题型二题型三题型四 (3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数,要想使所得估 计值更接近实际值,除应严格操作、多次重复外,还应保证待测样 品稀释的 。 (4)通常,对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特 征对细菌进行初步的 。 (5)培养大肠杆菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于 固体培养基,应采用的检测方法是 。 (6)若用大肠杆菌进行实验,使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才能丢弃,以防止培养物的扩散。 题
15、型一题型二题型三题型四 解析:(1)大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、 易培养、生活周期短等优点。培养过程中,除考虑营养条件外,还 要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(2)灭菌是指使用强烈的理 化因素杀死物体内外所有的微生物,对培养基和培养皿需进行灭菌。 消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的 部分微生物,操作者的双手需要进行清洗和消毒。紫外线能使蛋白 质变性,还能损伤DNA的结构。(3)稀释涂布平板法是将菌液进行 一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体 培养基的表面进行培养,应保证样品稀释的比例合适。(4)对获得的 纯菌种还可以依据菌落的形
16、状、大小等菌落特征对细菌进行初步 的鉴定。 题型一题型二题型三题型四 (5)培养大肠杆菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于 固体培养基,应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度 下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生。(6)因为有的大 肠杆菌会释放毒素,并可能导致肠道出现严重症状,所以,使用过的 培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃,以防止培养物的 扩散。 答案:(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短 (2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构 (3)比例合适 (4)鉴定(或分类) (5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养 基上是否有菌落产生 (6)灭菌