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1、第九单元 生物技术实践 专题26 微生物的利用,高考生物（浙江专用）,考点 微生物的利用 考点清单,基础知识 一、微生物的实验室培养 1.培养基 (1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖 的营养基质。 (2)成分:一般都含有碳源、氮源、水和无机盐,还需要满足不同微生物 生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。,2.无菌技术,3.实验操作 牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备: 计算称量溶化灭菌 倒平板 。 二、细菌的分离方法:划线分离法和涂布分离法 1.划线分离法 (1)方法:用接种环蘸菌液后在含有 固体 培养基的平板上划线,使,聚集的菌种分散到培养基的表面。每个 菌落 就是
2、一个细菌产生 的后代。 (2)应用:用于基因工程的大肠杆菌等工程菌,可以用划线分离法获得产 物表达能力高的菌株。工程菌的质粒中通常有 抗性基因 (如抗 氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程 菌和其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程 菌能生存下来。 2.涂布分离法:先将培养的菌液 稀释 ,通常稀释10-710-5倍,然后取 0.1 mL稀释度不同的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀 涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的 菌落 。,3.二者比较:划线分离法,方法 简单 ;涂布分离法,单菌落更易分开, 但操作 复杂
3、 。 三、大肠杆菌的培养和分离 1.大肠杆菌:革兰氏 阴性 、兼性厌氧的肠道杆菌。 2.细菌的繁殖:以 分裂 的方式繁殖,分裂速度很快。 3.细菌的扩大培养:用 LB液体 培养基,划线分离用 LB固体平面 培养基。 4.大肠杆菌的分离操作技术 最常用的方法是划线分离法,其操作步骤是: a.培养基灭菌:将刚配制好的50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培 养基分别装入两个250 mL的三角瓶中,加上封口膜,用 高压锅或灭 菌锅 进行灭菌。,b.倒平板:在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中,使培养 基铺满培养皿底部,待凝,使之形成平面。 c.接种扩大培养:靠近酒精灯火焰将大肠杆
4、菌接种到三角瓶的 液体 培养基 中,三角瓶在37 ,每分钟200转的摇床中振荡培养12 h。 d.划线分离:将摇床上培养12 h的菌液在固体培养基的平板上 连续 划线 ,然后将盖好的培养皿倒置,放在37 恒温培养箱中进行培养,12 24 h后,可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分 离。 e.菌种保存:在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用 划线 法 接种在空白斜面上,在37 下培养24 h后,置于4 冰箱中保存。,四、分离以尿素为氮源的微生物 1.实验原理:不同微生物利用氮源种类 不同 。有一些细菌含有脲 酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生 NH3 ,使培
5、养基的pH由原来的中性变为 碱性 ,于是培养基中的 酚红由红黄色变成 红色 。 2.实验步骤: (1)制备培养基:在60 左右时,将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基 和 尿素 固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,摇匀后 平放至凝固。 (2)制备细菌悬液:在无菌条件下,将1 g土样加到有99 mL无菌水的三角 瓶中,振荡10 min,即成10-2土壤稀释液,依此方法制备10-3、10-4和10-5的土 壤稀释液。,(3)涂布法分离:取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1 mL,分别加到有LB培养 基和尿素培养基的培养皿中,用通过 灼烧法 灭菌的玻璃刮刀将 菌液涂布到整个平面上。 (4
6、)培养和观察:在37 恒温箱中培养2448 h,观察 菌落数 。 3.预测本实验的结果:LB全营养固体培养基上的菌落 多而杂 ;尿 素固体培养基上的菌落 少而纯 ,一定时间内,菌落周围出现 红色 区域。用浓度为10-4和10-5的土壤稀释液接种,更容易形成单菌落 的是 10-5 土壤稀释液。,重难突破 一、无菌技术的知识归纳 1.灭菌原因:为了获得纯净的培养物,关键是要防止外来杂菌的污染。 2.无菌操作的条件: (1)各种器皿必须是无菌的; (2)各种培养基必须是无菌的; (3)细菌转移操作的过程必须是无菌的。,3.三种常用灭菌方法的比较,4.避免被杂菌污染的方法 (1)注意灭菌操作原则,灭菌
7、彻底,降低环境污染概率,手和实验服要清洁, 减少操作时间,对污染源的改善考虑周到。 (2)注意微生物生长条件,如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱的 环境,喜蛋白质丰富的营养物质,喜37 的温度;而霉菌喜中性偏酸的环 境,喜糖类丰富的营养物质,喜25 30 的温度。因此,可以根据不同 微生物的“喜好”来减少污染。,二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题 1.划线分离操作中的有关问题 (1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结 束后,仍然需要灼烧接种环。,(2)在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀 死菌种。 (3)在做第二次以及其后的划线操作时
8、,要从上一次划线的末端开始划 线。每次划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一 次划线的末端开始划线,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减 少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 2.进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因 如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开, 会冲散菌体,污染菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必 须倒置。,3.培养后判断是否有杂菌污染的方法 (1)从菌落的形态看,湿润度、透明度、黏稠度,呈何种颜色等,是区别细 菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。 (2)用显微镜镜检,观察菌的形态、大小,菌丝、孢子、芽孢等也是区别 细菌、
9、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。 (3)上述方法较难区分同类的不同物种,需要借助化学方法和进一步的 形态观察,如用革兰氏染色法,观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方 式、菌丝生长方式、芽孢等。 三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析 1.土样的获得:从有哺乳动物排泄物的地方取得。,2.实验步骤:,3.两种常用微生物接种方法比较,【知能拓展】 (1)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯 化的混合物,内含一定量的含氮化合物,不利于以尿素为氮源的细菌的 筛选。 (2)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红),标志着存在脲酶水解尿 素的作用,从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小 代
10、表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大,表明菌株利用尿素 的能力越强。 (3)与全营养培养基上的菌落数比较,尿素培养基上只有少数菌落,这一 现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。,方法 区分消毒与灭菌 方法技巧,【思维点拨】 (1)高温加热灭菌,其原理就是使细菌体内的蛋白质变 性,从而达到杀灭细菌的作用。 (2)化学药剂消毒的方法,其作用原理是使细菌体内蛋白质变性,但是化 学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内,因此化学方法难以 消灭孢子和芽孢。 (3)体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强。浓度过低,杀菌力弱;浓度过 高,使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜,乙醇分子不能渗入细菌内,杀 菌效果受影响。对刚洗刷后未干的器皿,则可选择75%的酒精进行消毒。 (4)灭菌的目的:无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微 生物污染外,还能有效避免操作者自身被微生物感染。,(5)培养基的制作是否合格的验证:如果未接种的培养基在恒温箱中保温 12天后无菌落生长,就说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。,