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1、专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段【学习目标】1.说出PCR技术的基本操作 2.理解PCR的原理3.讨论PCR的应用【重点难点】PCR的原理和PCR的基本操作【预习案】任务一. PCR原理填写下列表格参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链合成子链的原料DNA聚合酶引物DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为 ，而磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控制 来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，
2、这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ， ， ，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。任务二PCR的反应过程PCR一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能 ，使这段固定长度的序列成指数扩增。任务三. 实验操作在实验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。
3、具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。任务四操作提示为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要 。【训练案】1. 在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开 A. 1020 B. 80100 C. 2030 D. 40602. 关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DN
4、A链B. DNA复制不需要引物C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D. DNA的合成方向总是从子链的3端向5端延伸3. 下列有关PCR描述，不正确的是（ ）A. 是一种酶促反应B. 引物决定了扩增的特异性C. 扩增产量按y（1X）nD. 扩增对象是氨基酸序列E. 扩增对象是DNA序列4.（1）PCR反应需要的条件：缓冲溶液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，为什么？（2）在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是：_。5. 空难之后对面目全非的航天员遗体残骸辨认可借助DNA杂交技术。该技术是从尸体和死者家属提供的死者生前的生活用品中分别提取DNA，在一定温度下水浴共热
5、，使DNA的氢键断裂，双链打开。若两份DNA样本来自同一个体，在温度降低时，两份样本中的DNA单链会通过氢键连接在一起；反之，则不能互补。已知某DNA单链碱基组成为ATCCGAT，则与它互补的另一条单链组成为_，为保证准确性，需用较多的DNA样品，这可以通过一定的技术使DNA分子大量复制，若一个DNA分子中，腺嘌呤含量为15，复制所用的原料均为3H标记的脱氧核苷酸，经四次复制后，不含3H的DNA单链占全部单链的_ _，子代DNA分子中胞嘧啶的比例为_ 。6. TaqDNA聚合酶的特点是（ ） A. 耐高温 B. 耐盐酸 C. 耐强碱 D. 不耐热7. PCR的每次循环都可以分为三步，按循环的顺
6、序排列是（ ） A. 变性、延伸、复性 B. 变性、复性、延伸 C. 复性、变性、延伸 D. 延伸、变性、复制8. DNA复制时，合成DNA新链之前必须合成（ ） A. DNA引物 B. RNA引物 C. 新的脱氧核苷酸 D. 核苷酸9. （1）PCR与生物体内的DNA复制有何区别？（2）PCR每次循环都可分为_、_和_三步。（3）_的发现和使用大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向_。（4）PCR通过控制_来控制双链的_与_。（5）PCR反应需要一定的缓冲溶液中提供_分别与两条模板结合的_、_种脱氧核苷酸、_的DNA聚合酶。（6）从第二轮循环开始，DNA聚合酶只能特异的复制_的DNA序列，
7、使这段_的序列呈指数扩增。记忆大餐1.PCR技术简介PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。2细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用解旋酶：打开DNA双链 DNA母链：提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基
8、序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸）3DNA的合成方向DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。4PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（
9、温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。5PCR技术与DNA的复制PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）