中国药品检验标准操作规程2010版细菌内毒素检查法.pdf

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1、细菌内毒素检查法 1 简述 1. 1 本规范适用于中国药典2010 年版二部附录E 细菌内毒素检查法凝胶法和光度测定 法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有 争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1. 2 供试品细菌内毒素限值的确定 1. 2. 1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值； 1. 2. 2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： LKM 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EUml 、EUmg、EUU 等表示。 K 为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU(kgh) 表示

2、。 其中注射剂，K5EU(kgh)；放射性药品注射剂，K2. 5EU(kgh)；鞘内用药品，K0. 2EU (kgh)。 M 为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg h)、mg(kgh)、U(kgh) 等表示。 药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅临床用药须知，中国人均体重按60kg 计算，注 射时间小于1h 的按 1h 计。若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0. 027 即可转 换为每千克体重剂量即M： （最大给药剂量(m h)1. 62m ） 60kg 。 1. 3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MVD ）按下式计算： MVD CL

3、 L 为供试品的细菌内毒素限值，当L 以 EUml 表示时， C 等于 1.0mlm1；当 L 的单位以EU mg 或 EUu 表示时， C 为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mgml 或 Uml。 在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC ）按下式计算：MVC L。 1. 4 药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检 验中出现干扰的情况需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研 究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。

4、 2 实验材料及用具 2. 1 天平供试品称量用，精度为0. 1mg 以下。 2. 2 电热干燥箱用于去除外源性内毒素，温度应能达到250。 2. 3 恒温水浴箱或适宜的恒温器（37 1） 。 2. 4 水银温度计或酒精温度计，精度在1以下。 2. 5 旋涡混合器。 2. 6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。 2. 7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制 品检定所统一发放的标准品。 2. 8 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0. 015EUml（用于凝胶法）或0. 005EUml（用 于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

5、 2. 9 实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（ 10mm75mm） 、三 角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75乙醇棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250干 烤 30 分钟以上。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且 对试验无干扰的器械。 2. 10 细菌内毒素光度测定仪器。 3 实验准备 3. 1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取 出将洗液控干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，控干后放入适宜的密闭 金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入电热

6、干燥箱。 3. 2 玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250， 待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250干烤 30 分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待干 燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装， 在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 3. 3 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般 要求供试品溶液的pH 值在 6. 08. 0 的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被 测溶液（或其稀释液）的pH 值

7、，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内 毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 4 凝胶法操作方法 4. 1 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正 确及试验条件是否符合规定。 因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须 进行鲎试剂灵敏度复核试验。 4. 1. 1 实验操作 4. 1. 1. 1 细菌内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部 轻轻划痕，

8、 75乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落人瓶内。 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋 涡混合器上混合15min。然后进行稀释，制备成4 个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2、1、0. 5、 0. 25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟（详细过程 请参见标准品使用说明书）。 若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细 菌内毒素工作标准品，为一次性使用。 4. 1. 1. 2 待复核鲎试剂的准备 取规格为0.1ml支的鲎试剂18 支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底

9、，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精 棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0. 1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物 充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0. 1ml支时，取 |若干支按其标示量加入检查用 水复溶， 充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每 0. 1 分装到 10mm 75mm 凝集管中，要求至少分 装 18 支管备用。 4. 1. 1. 3 加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18 支（管）放在试管架上，排成5 列，其中4 列 4 支（管），1 列 2 支（管）。4 支（管） 4 列每列每支分别加入0. 1ml 2、1、0. 5 、0. 25的内毒素 标

10、准溶液；另2 支（管）加入0. 1ml 检查用水。 4. 1. 1. 4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入 37 1水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min2min。 4. 1. 1. 5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180观 察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（十）；未形成凝胶或形成的凝 胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴 性结果。 4. 1. 2 实验结果计算 当最大浓度2 4 管均为阳性，最低浓度0. 25

11、 4 管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效， 按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c） )4(lg 1 X c 式中 X 为反应终点浓度的对数值（1g） ，反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈 阳性结果的浓度。 4. 1. 3 结果判断 当 c在 0. 52（包括 0. 5和 2）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供 试品细菌内毒素检查，并以（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。 4. 1. 4 举例 如待复核鲎试剂标示灵敏度为0. 125EUml。实验结果如下： 内毒素浓度（EUml）0. 25 0. 125 0. 0625 0. 031

12、 NC 反应终点浓度 重 复 管 数 1 0. 125 2 0. 25 3 0. 0625 4 0. 0625 )ml/EU(105.0 4/)0625.0lg0625.0lg25.0lg125.0(lglg )4X(lg 1 1 c c在 0. 52范围内，符合规定。以标示灵敏度0. 125EUml 为该批鲎试剂的灵敏度。 4. 2 干扰试验 4. 2. 1 操作方法 干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作 用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变 或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作

13、用。 由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的 灵敏度无关，因此在干扰试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0. 5EU ml 或 0. 25EUm1）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响。 4. 2. 1. 1 干扰试验预实验 预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU mg 或 EU U 表示）或最小不 干扰稀释倍数（当限值以EUml 表示），为正式干扰试验提供依据。 4. 2. 1. 1. 1 将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD CL0

14、.03（0. 03EU ml 为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。 4. 2. 1. 1. 2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2 支供试品管和2 支供试品 阳性对照 （即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2浓度）。另取 2 支加入细菌内毒素检查用 水作为阴性对照，2 支加入 2浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。 供试品阳性对照溶液制备举例：制备稀释倍数为4 的供试品阳性对照液方法：取0. 3ml 浓度为4.0 EUml 的内毒素标准液0. 3ml 稀释倍数为2的供试品稀释液，制得0. 6ml 含 2 EUml 内毒素 标准液的稀释倍数为4 的供试品稀释液。 保温（ 6

15、0 士 2） min 后，观察并记录结果。 4. 2. 1. 1. 3 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2 管为阴性，供试品阳性对照2 管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不 干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。 当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明供试品对内 毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD CL0.03） ，或通 过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地 排除干扰且不会使内毒素失去

16、活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试 验。 当供试品的内毒素限值单位为EUmg 或 EUU 时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰 浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以 mgml 或 Uml 表示。 4. 2. 1. 1. 4 举例 例：设某注射液限值为2.5EUml，按 MVD CL计算出灵敏度为0. 03EUml 下的 MVD 为 83 倍，将供试品溶液稀释一系列进行检验，用灵敏度为0. 25EUml 的鲎试剂进行预实验。结果如下： 稀释倍数原液5 10 20 40 80 供试品溶液 供试品阳性对照 如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20 倍，可

17、在此浓度下进行正式干扰试验。 4. 2. 1. 2 干扰试验 目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。 4. 2. 1. 2. 1 制备内毒素标准对照溶液 取 1 支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4 个浓度的标准溶液即2、l、0. 5、 0. 25（方法同 4. 1. 1. 1. ） 。 4. 2. 1. 2. 2 制备含内毒素的供试品溶液 4. 2. 1. 2. 2. 1 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4. 2. 1. 2. 1 中的 同一支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2、1、0. 5、0. 25的含内毒素的供试品溶液

18、。 以注射用头孢哌酮钠1g（瓶）为例：取10ml 检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mgml，用 内毒素检查用水将其稀释20 倍（即 5mgm1）后备用。（注：冻干品或无菌粉末检查用水溶解后体积有 无变化，根据具体情况定。） 取一支细菌内毒素标准品，加入 1ml 细菌内毒素检查用水溶解，混匀后使用5mgml 头孢哌酮钠溶 液作为溶剂将细菌内毒素标准品依次稀释至2、1、0. 5和 0. 25 4 个浓度。 4. 2. 1. 2. 2. 2 简化法制备含内毒素的供试品溶液 0. 5ml 浓度为 4.0 的内毒素标准溶液0. 5ml 浓度为 10mgml 的供试品溶液，得到1ml 的含 2 内毒

19、素的浓度为5mgml 的供试品溶液。 同理分别用0. 5ml 浓度为 2、l 和 0. 5的内毒素标准溶液制备含1、0. 5和 0. 25内毒素的 浓度为 5mgml 的供试品阳性对照溶液。（其体积的大小视情况而定）。 4. 2. 1. 2. 3 鲎试剂的准备 取规格为0.1 ml支的鲎试剂36 支，轻弹瓶壁使粉末落人瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75乙醇 棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。每支加入0.1 ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物 充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0. 1ml支时，按其标示量加入检查用水复溶， 将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0. 1

20、m1 分装到 10mm 75mm 凝集管中，要求至少分装36 管 备用。 4. 2. 1. 2. 4 加样 将准备好的鲎试剂取其中18 支（管）放在试管架上，排成5 列， 4 列 4 支（管）， l 列 2 支（管）。 其中的 4 列 4 支每列每支分别加入0. 1ml 的 2、1、0. 5、0. 25的内毒素标准溶液，另一列2 支 （管）加入0.1 ml 检查用水作为阴性对照。 将另外 18 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5 列， 4 列 4 支（管），1 列 2 支（管）。其中的4 列 4 支每列每支分别加入0. 1ml 含 2、1、0.5、0. 25的内毒素的供试品溶液，另一列2 支（

21、管） 加入 0.1 ml 供试品溶液作为样品阴性对照。 加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37 1水浴或适 宜恒温器中，保温（602） min 后，观察并记录结果。 4. 2. 2 实验结果计算 如两组最大浓度2均为阳性，最低浓度0. 25 均为阴性，阴性对照4 管均为阴性时，按下式计算 用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的 内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et） 。 )4X(lgE )4X(lgE t 1 t s 1 s 式中 Xs、 Xt分别为检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终

22、点浓度的对数值（lg） 。 4. 2. 3 结果判断 当 Es在 0. 52（包括 0.5和 2）时，且Et在 0. 5Es2. 0Es（包括 0. 5Es和 2. 0Es）时，则 认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当 Et不在 0. 5Es2. 0Es（包括0. 5Es和 2. 0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰试验。应使用适 宜方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数的稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。建立新品种细菌 内毒素检查方法时，每个厂家至少取3 个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的 鲎试剂进行干扰试验。 4. 2. 4

23、 举例 设供试品为某注射液，预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20 倍，使用灵敏度为0. 25EU ml 的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。 内毒素浓度（EUml）0. 5 0. 25 0. 125 0. 0625 Nc 反应终点浓度 内毒素标准溶液 0. 125 0. 125 0. 125 0. 125 含供试品的内毒素溶液 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 )ml/EU(125.0 4/)125.0lg125.0lg125.0lg125.0(lglg )4X(lgE 1 s 1 s )ml/EU(25.0 4/)25.0lg25.0lg25.0lg25.0(lg

24、lg )4X(lgE 1 t 1 t Et在 0. 5Es2. 0Es范围内，说明该供试品进行 20 倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓 度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。 4. 3 供试品细菌内毒素检查 在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2 支供试品管和2 支供试品阳性对照，同时每次实验须做 2 支阳性对照和2 支阴性对照。 4. 3. 1 操作方法 4. 3. 1. 1 供试品溶液的制备 首先计算MVD CLC、L 的意义同1. 3。为所使用鲎试剂的标示灵敏度。然后将供试品 进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD 。 4. 3. 1. 2 阳性对照溶液的制备 用检查用水将标准品稀释

25、制成2 入浓度的内毒素标准溶液。 （方法同4. 1. 1. 1） 。 4. 3. 1. 3 供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2 入浓度的内毒素溶液。 （方法同4. 2. 1. 1. 2 供试品阳性对照溶液的制备）。 4. 3. 1. 4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水 4. 3. 1. 5 鲎试剂的准备 取规格为0. 1ml支的鲎试剂8 支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精 棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。每支加入0. 1ml 检查用水溶解。轻轻转动瓶壁，使内容物 充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0. 1ml

26、支时，取若干支，按其标示量加入检查 用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0. 1m1 分装到 10mm 75mm 凝集管中，要求 至少分装8 管备用。 4. 3. 1. 6 加样取 8 支（管）溶解好的鲎试剂，其中2 支加入 0. 1ml 供试品溶液或其稀释液（其 稀释倍数不得超过MVD ）作为供试品管，2 支加入 0. 1ml 阳性对照溶液作为阳性对照管（PC） ， 2 支加 入 0. 1ml 检查用水作为阴性对照（NC） ，2 支加入0. 1ml 供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管 （PPC） 。 4. 3. 1. 7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入3

27、7士1水浴或适宜恒温器 中，保温（ 60 土 2） min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 4. 3. 2 结果判断 当阳性对照、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照为阴性时，实验方为有效。若供试品2 管均为阴 性，认为该供试品符合规定；如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定；如2 管中一管为阳性，1 管 为阴性，按上述方法另取4 支供试品管复试，4 管中，如有1 管为阳性，即认为不符合规定。若第一次 实验时供试品的稀释倍数小于MVD 而结果出现2 管均为阳性或2 管中一管为阳性时，按同样方法重新 进行实验，实验时要求将其稀释至MVD 。 4. 3. 3 举例 供试品为葡萄糖注

28、射液，其内毒素限值为0. 5EUml，设所用鲎试剂的灵敏度为0. 125EU ml。 MVD CL0. 50. 1254 将样品进行4 倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。 供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照 结果是否有效有效 结果判断该批葡萄糖注射液内毒素含量小于0. 5 EU ml，符合规定。 4. 4 凝胶半定量实验 半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点 浓度计算出供试品中内毒素的含量。 4. 4. 1 操作方法 4. 4. 1. 1 供试品系列的制备 用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释。制备成2

29、、4、8 等 n 个浓度，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD 。n 可根据实验设计不同确定。 4. 4. 1. 2 内毒素标准系列的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释成4 个浓度的标准溶液即2、1 、0. 5、0. 25， （方法同 4. 1. 1. 1. ） 。 4. 4. 1. 3 供试品阳性对照溶液的制备 用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。 （方法同4. 2. 1. 1. 2 供试品阳性对照溶液的制备）。 4. 4. 1. 4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。 4. 4. 1. 5 鲎试剂的准备 取规格为0. 1ml支或分装好的鲎试剂1

30、22n 支，其他准备按干扰试验项下的“鲎试剂准备”。 4. 4. 1. 6 加样 将准备好的鲎试剂取其中10 支（管）放在试管架上，排成5 列，每列2 支。其中4 列每列每支分 别加入 0.1 ml 的 2、1、0. 5、0. 25的内毒素标准溶液，另一列2 支（管）加入0. 1ml 检查用水 作为阴性对照。 将另外2n 支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N 列，每列2 支（管）。每列每支分别加入0. 1ml 一个浓度的供试品溶液。 另 2 支（管）加入0. 1ml 供试品阳性对照溶液作为样品阳性对照。 4. 4. 1. 7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37 1水浴或适宜恒

31、温器 中，保温（ 602）min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 4. 4. 2 实验结果计算 如内毒素标准系列最大浓度2均为阳性，最低浓度0. 25均为阴性，阴性对照均为阴性，供试品 阳性对照为阳性时，按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（t）和供试品系列溶液 反应终点浓度的几何平均值（CE） 。 )2X(lgC )2X(lg E 1 E t 1 t 式中 Xt为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（ 1g） 。 XE为供试品溶液的反应终点浓度的对数值（ 1g） 。每个系列的反应终点浓度即每一系列平行管的终 点稀释倍数D 乘以鲎试剂标示灵敏度，所有平行管反应终点浓

32、度的几何平均值即为供试品溶液的内毒 素浓度。 4. 4. 3 结果判断 当 t在 0. 52之间，试验方为有效。供试品的内毒素含量即为供试品系列反应终点浓度的几 何平均值。 如果试验检验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。 如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于 （如果检验的是稀释过的供试品， 则记录为小于乘以该供试品的最低稀释倍数）。如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于 最大的稀释倍数乘以。 若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试 品不符合规定。 4. 4. 4 举例 设供试品为某注射液

33、，干扰试验已确定其最小不干扰稀释倍数为20 倍，其内毒素限值为10EUml， 现使用灵敏度为0. 03EUml 的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。 MVD CL100. 03320 倍 将供试品溶液先稀释至20 倍后，再进行对倍稀释。将20 倍稀释液再稀释2、4、8、 16 倍，同时制 备内毒素标准系列。 内毒素浓度 （ EUml） 0. 0625 0. 03 0. 015 0. 0075 Nc 反应终点浓度 内毒素标准溶液 0. 0625 0. 0625 供试品稀释倍数1 2 4 8 16 PPC 反应终点 稀释倍数D 反应终点浓度 D 供试品系列 8 4 0. 24 0. 12 )/(06

34、25.0 2/)0625.0lg0625.0(lglg )2(lg 1 1 mlEU X tt )ml/EU(170.0 2/)12.0lg24.0(lglg )2X(lgC 1 E 1 E t在 0. 5 2之间，试验为有效。 供试品 20 倍稀释液的内毒素含量为0. 170EUml。 由于供试品先被稀释了20 倍，因此供试品的内毒素含量为0. 170203. 40EUml，低于规定的 内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。 5 光度法操作方法 光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理， 可分为终点浊度法和

35、动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊 度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的 浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物释放出有色团的多少 而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合 物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方 法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度

36、 增长速度的方法。 5. 1 仪器的设置 浊度法分为终点浊度法和动态浊度法，显色基质法也分为终点显色法和动态显色法。针对不同的方 法，应配置相应的测定仪器。 在实验开始前，应根据仪器的说明和实验的设计设定反应时间，反应温度（一般为37士1） ， 检测波长等相关系数。 供试品和鲎试剂的分装加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，需参照所用仪器和试剂的 有关说明进行。 5. 2 标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可 靠性试验。 5. 2. 1 实验操作 5. 2. 1. 1 细菌内毒素标准溶液的制备 用检查用水将一支内毒素

37、标准品溶解稀释，并制成至少3 个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不 得大于 10） ，如 10、1、0.1EU ml 或 0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625、0. 03EUml，但最低浓度不得低于 所用鲎试剂的标示检测限。稀释操作方法同凝胶法。 5. 2. 1. 2 鲎试剂的准备 要求内毒素标准系列中每一浓度至少做3 支平行管，并要求同时做2 支阴性对照。根据所制备的标 准曲线中浓度的个数来计算所需要的鲎试剂体积。 由于凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂在工艺上有所不同，因此在进行光度法检测时需使用专用鲎 试剂而不能用凝胶法鲎试剂代替。光度法鲎试剂都为0. 5ml 以上装量，在溶解

38、后需将所有鲎试剂混合在 一起，备用。 5. 2. 1. 3 加样 将标准内毒素溶液和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，如小试管或微孔 板。再加入要求体积的鲎试剂，轻轻混匀， 避免产生气泡， 然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。 5. 2. 2 结果判断 当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0. 980，试验方为有效。否则 须重新试验。 5. 3 干扰试验 干扰试验的目的同凝胶法干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中 发生了任何有可能影响试验

39、结果的变化时，须重新进行干扰试验。 5. 3. 1 实验操作 5. 3. 1. 1 标准曲线的制备 操作同 5. 2. 1. 1。 5. 3. 1. 2 将供试品进行一系列的稀释，但不得超过MVD 。选择标准曲线中点或一个靠近中点的内 毒素浓度，设为m，作为添加到供试品中的标准内毒素浓度。可按如下方法制备供试品每一稀释倍数 下的样品阳性对照： 如使用的标准曲线为50、5、0. 5、0. 05EUml 的标准系列，选择0. 5EUml 浓度作为 m。现需 制备稀释倍数为4 的供试品阳性对照液。 可取 0. 3ml 浓度为 1. 0EUm1 的内毒素标准液0. 3ml 稀释倍 数为 2 的供试品稀

40、释液，制得0. 6ml 含 0.5EUml 内毒素标准的稀释倍数为4 的供试品稀释液。 也可按仪器或试剂厂商提供的其他方法配制。 5. 3. 1. 3 鲎试剂的准备 根据标准曲线及供试品浓度个数来计算所需要的鲎试剂体积。鲎试剂溶解后需将所有试剂混合在一 起，备用。 5. 3. 1. 4 加样 标准曲线每个浓度不少于2 支平行管，供试品每个浓度不少于2 支平行管，同时供试品每个浓度的 样品阳性对照也不少于2 支平行管。并用检查用水做2 支阴性对照。 将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应 容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，

41、避免产生气泡，然后将反应容器放 入光度测定仪中进行反应。 5. 3. 2 实验结果计算 当反应完毕后，仪器自动生成标准曲线并按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒 素的供试品溶液的内毒素含量Ct 和 Cs，按下式计算供试品每一浓度的回收率（R） 。 %100m/)CtCs(R 5. 3. 3 结果判断 当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于 或等于 0. 980，试验有效。 当供试品的内毒素的回收率在50 200之间时， 则认为在此浓度下供试品溶液不存在干扰作用。 当供试品系列的内毒素的回收率都不在指定的范围内，可重新制备最低浓度

42、（ ）更低的标准曲线 （但不得超过使用鲎试剂的最低检测限），从而提高MVD ，将供试品进行更大倍数的稀释来排除干扰。 或按“凝胶法干扰试验”中提及的其他适宜方法去除干扰因素，并要重复干扰试验来验证处理的有效性。 5. 4 供试品细菌内毒素检查 5. 4. 1 实验操作 5. 4. 1. 1 标准曲线的制备 标准溶液的制备操作同5. 2. 1. 1。 5. 4. 1. 2 将供试品稀释至一个已证实无干扰作用的浓度，并同时制备该浓度下的供试品阳性对照。 5. 4. 1. 3 鲎试剂的准备及加样 标准曲线每个浓度不少于2 支平行管，供试品不少于2 支平行管，供试品阳性对照也不少于2 支平 行管。并用

43、检查用水做2 支阴性对照。 将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应 容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生气泡。然后将反应容器放 人光度测定仪中进行反应。 5. 4. 2 结果判断 当反应完毕后，使用标准曲线来计算供试品的每一个平行管的内毒素浓度。 试验必须符合以下3 个条件方为有效： ： （ 1）标准曲线的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求。 （ 2）该浓度下的内毒素回收率要在50 200的范围内。 （ 3）阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间。 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍

44、数后，小于规定的内毒素限值。判供试品符 合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。 6 注意事项 6. 1 实验前，须用肥皂洗手，用75乙醇棉球消毒。 6. 2 在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的 内毒素进入供试液。 6. 3 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。 6. 4 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以 免使凝胶破碎产生假阴性结果。 6. 5 进行干扰试验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。 6. 6 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试

45、品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应 同时进行，并在实验有效的情况才能进行计算和判断。 6. 7 实验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生物的污染。 7 细菌内毒素检查法方法建立的指导原则见附件。 附件： 细菌内毒素检查法建立的指导原则 1 简述 1. 1 本法基于中国药典2010 年版附录中细菌内毒素检查法凝胶法和光度测定法以及 细菌内毒素检查法 ，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行实验及研究。 1. 2 需建立内毒素检查项目的品种 质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。 用于注射给药（静脉滴注、静脉注射、鞘内注射、腹腔注射及剂量较大的肌内

46、注射等），但未采用 细菌内毒素检查法或家兔热原检查法其一控制质量的注射用药品、生物制品以及未上市需建立质量标准 的注射用新药。 用于静脉给药的原辅料，包括易污染内毒素的原料（如抗生素）、无菌分装原料、制剂工艺中无除 内毒素和无灭菌过程产品的原料药（如生化药品、生物制品）及在制备分装过程无法控制内毒素的原辅 料，应设置细菌内毒素检查项。 1. 3 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查方法时，为验证不同样品和不同鲎试剂反应的一 致性，要求同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂对每个品种至少三批样品（如为上市品种应检测两个以上 生产厂家的样品；如为新药需检测连续生产的样品）进行干扰试验，以确定该品种是否对

47、内毒素和鲎试 剂的反应存在干扰作用，能否使用内毒素检查法进行检验。 如同一样品对两种鲎试剂结果差异较大，应使用第三厂家的鲎试剂以探讨采用内毒素检查法的可能 性。 1. 4 若经过方法学验证证实样品对细菌内毒素检查存在不能排除的干扰作用，不能建立细菌内毒 素检查项时，应采用热原检查控制注射剂的质量。 2 建立细菌内毒素检查实验方法 2. 1 确定内毒素限值 2. 1. 1 注射用药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按公式L KM 计算，详见细菌内 毒素检查法实验操作规范。 其中 M（人每公斤体重每小时临床最大用药剂量）应依据药品使用说明书或国家药典委员会编制的 临床用药须知确定。如儿童用药剂

48、量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。 2. 1. 2 为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的 药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的l2 或 13。 2. 1. 3 对于体积在100ml 以上（包括100m1）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0. 5EU ml 计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EUmg 或 EUU 表示。 2. 1. 4 对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典 规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值， 应以最新版本药典为准。 2. 2 实验准备 2. 2. 1 实验材料、用具的准备详见细菌内毒素检查法实验操作规范。 2. 2. 2 实验所用样品本身内毒素含量须较低，与所用凝胶法鲎试剂反应应为阴性。如内毒素含量 过高，与凝胶法鲎试剂反应出现阳性结果，则难以判