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1、转运体临床前研究评价的一些实验方案 FDA推荐主要研究的七个转运体及其底物、抑制剂 转运体推荐特异底物推荐特异抑制剂 P-gp/MDR1 地高辛、洛派丁胺、小檗碱、伊立替康、阿霉素、长春 碱、紫杉醇、非索非那定 环孢霉素、奎尼丁、 Tariquidar、维拉帕米 BCRP/MXR 米托蒽醌、氨甲蝶呤、拓扑替康、伊马替尼、伊立替康、 他汀类、硫酸结合物、卟啉类化合物 雌（甾）酮、 17- 雌二 醇、 fumitremorgin C OATP1B1 Bromosulphophthalein、oestrone-3-sulphate、 oestradiol-17-glucuronide、他汀类、瑞格列
2、奈、缬 沙坦、奥美沙坦、葡萄糖醛酸胆红素、胆红素、胆汁酸 沙奎那韦、利托那韦、 洛 匹那韦、利福平、环孢霉 素 OATP1B3 Bromosulphophthalein、缩胆囊素8、他汀类、地高辛、 非索非那定、替米沙坦糖苷、替米沙坦、缬沙坦、奥美 沙坦、 oestradiol-17-glucuronide、胆汁酸 利福平、环孢霉素、 利托 那韦、洛匹那韦 OAT1 对氨基马尿酸盐、阿德福韦、西多福韦、齐多夫定、拉 米夫定、扎西他宾、阿昔洛韦、替诺福韦、环丙沙星、 甲氨蝶呤 丙磺舒、新生霉素 OAT3 Oestrone-3-sulphate、非甾体抗炎药、头孢克洛、头孢 唑肟、利尿磺胺、布美他
3、尼 丙磺舒、新生霉素 OCT2 N-Methylpyridinium、四乙铵、二甲双胍、心得乐、普 鲁卡因胺、雷尼替丁、金刚烷胺、阿米洛利、奥沙利铂、 varenicline 西咪替丁、吡西卡尼、 西 替利嗪、睾酮、奎尼丁 *底色为黄色的表示潜在临床可用。 七个转运体主要分布组织/ 细胞 转运体主要分步组织及细胞 P-gp/MDR1 小肠上皮细胞、肾近曲小管、肝细胞（胆小管面）、 脑内皮细胞 BCRP/MXR 小肠上皮细胞、肝细胞（胆小管面）、肾近曲小管、 脑内皮细胞、胎盘、干细胞、乳腺 OATP1B1 肝细胞（窦状隙面） OATP1B3 肝细胞（窦状隙面） OAT1 肾近曲小管、胎盘 OAT
4、3 肾近曲小管、脉络丛、血脑屏障 OCT2 肾近曲小管、神经元 外排转运体 (P-gp 、BCRP) 1.作用底物鉴定 FDA总体要求：所有药物都需要进行鉴定是否为P-gp、BCRP的底物 流程如下： 注： 1. P-gp 底物鉴定决策树对BCRP近似适用。 2. 除了传统双向转运评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞 单层（转染P-gp/BCRP 、使用阳性对照） ，也可以运用到底物鉴定实验中。 2.抑制作用鉴定 FDA总体要求：所有药物都需要进行鉴定是否对P-gp、BCRP有抑制作用。 注： 1、P-gp 抑制剂鉴定决策树对BCRP近似适用。 2、除了传统双向转运
5、评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞 单层（转染P-gp/BCRP 、使用阳性对照） ，也可以运用到抑制剂鉴定实验中。 I1为临床最大给药剂量下所达到的最大稳态血浓；I2为临床最大口服给药剂量下将胃 肠道容积视为250ml 时药物在胃肠道的最大浓度。 实验方案： 1.Caco-2细胞： 准备工作： Caco2细胞培养传代，选择对数生长状态细胞种板，培养21 天，测细胞 电阻以及做单层细胞模型验证实验（甘露醇以及地高辛） 双向转运实验： 用 hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 将培养好的细胞洗涤23 次。最后一次洗涤后测定 跨上皮电阻值以监控细胞质量。然后在细胞层的
6、基底面一侧( basolateral side, BL) 换 上 HBSS, 在绒毛面一侧 (apical side, AP)换上含有待测药物的HBSS, 以及相反操作, 在 37恒温摇床中释药, 模拟体内吸收情况, 间隔一定时间取样。计算 表观渗透系数 (Papp)计算公式为 : 其中为渗透速率,Co 为供药室中被测药物的初始浓度,A 为细胞单层的表面积 计算 Pb-a/Pa-b比值。 2.囊膜转运：（ABC转运体囊泡是从杆状病毒感染的昆虫细胞表达获得） 流程： 首先进行 NME 抑制性试验， 得到 NME 的 IC50 值。 （需要先考察需要特异底物浓度、 转运实验时间）可能产品说明书中能
7、够提供案例说明上述考察项 然后进行 NME 底物确证实验（选用IC50值上下的两个浓度进行实验） NME 抑制性试验过程： 底物 +AMP 阳参 +底 物 +ATP 底物 +ATP+ 不同浓度考察药物（0 M 及后续升高浓度）n=2 反应体系：可能产品说明书中能够提供。 后处理方法： 加入 0.2ml 的冰冷缓冲液终止反应，转运液迅速抑制96 孔滤板， 通过 F 级玻璃纤维滤膜（0.7 m 孔径）进行快速真空抽滤，滤膜冲洗后，加入0.2ml 洗 脱液，真空抽滤收集滤液。 评价方法：将药物浓度为0 时的底物转运率记为100%，计算体系中加入不同浓度 药物时的相对转运率，IC50值为相对转运率为5
8、0%时的体系药物浓度。 NME 底物确证实验（n=2） 阳参 + ATP ATP+考察药物（ IC50附近选择两个浓度）不同时间点终止反应 AMP+考察药物（ IC50附近选择两个浓度）n=2 反应体系和后处理方法同上 评价方法：计算各时间点、各浓度主动转运进入膜囊（ATP ）和非特异性吸附(AMP) 的药量之比。若比值随药物浓度增加、随时间增加而增加，则说明为底物。 3.细胞转染：（见最后） 附：ATPase实验 ATP酶分析能够提供关于一个分子和转运体亲和力的信息，但是无法提供 转运速率。（初步判断是否为底物） 实验方案： 阴性 AMP 阳 性 对照 ATP+不同浓度药物 (n=2) 不同
9、 + 药 ATP +特 异 底 物 时间 点（5, 15,30, 45,60 min） 反应体系：可能产品说明书中有推荐。 后处理方法： 10%SDS终止反应。加入200 l 显色剂（ 35mM 钼酸铵 +15 M 乙酸锌： 10%坏 血酸） ，37孵育 20min 并测定 750nm紫外吸收。 若随药物浓度、 随时间增加Pi 生成量明显 增加，判断药物为转运体底物。 溶质载体转运体： 底物鉴定实验： 由于各转运体分布差异，在药物清除中的作用不同。需要首先进行在体实验，了解 药物的主要清除途径。 实验概述：将同批次大鼠随机分为四组。 组一静脉给药，收集各时间点血浆，并算得总清除率。 组二静脉给
10、药，收集各时间段尿液，算得肾清除率。 组三制作胆管插管模型，静脉给药，收集各时间段胆汁，算得肝清除率。 组四静脉给菊粉，收集各个时间段尿液，算得肾小球率过滤。 将所得结果进行比较。 1.鉴定是否为OAT1 /3、 OCT2底物 2.鉴定是否为OATP1B1 、 OATP1B3底物 需要做的实验： （见最后） 抑制作用鉴定实验： 1.OCT 、OAT抑制剂鉴定 2.OATP抑制剂鉴定 细胞转染实验： 选用 HEK293T细胞 实验基本流程： 设计目的基因PCR所需引物细菌中所含目的基因的质粒DNA的抽提PCR PCR产物回 收酶切， 构建重组质粒制备感受态细胞转化获取质粒DNA 并进行阳性克隆PCR 筛选 HEK293T细胞复苏、传代转染检测蛋白表达情况 测定方法学考察 考察药物对HEK293T细胞毒性 细胞转运实验： （需要先考查时间、浓度、pH 对细胞摄取药物影响的情况） 抑制细胞转运实验