固相合成基础SPPS.docx

1、固相合成基础S PPS作者:日期：、多肽合成概论1 .多肽化学合成概述:196 3年,R. B.Merri field 1创立了将氨基酸的 C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上 依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield 获得19 84年诺贝尔化学奖.？ 今天，固相法得到了很大发展.除了Me r r i field 所建 立的Boc法（B o c:叔丁氧段基）之外，又发展了 F moc固相法（Fmoc:9-药甲氧段基）.以

2、这两种方法为基 础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善Mer rifield 所建立的Boc合成法2 是采用T FA （三氟乙酸）可脱除的Boc为“-氨基保护基，侧链保 护采用土醇类.合成时将一个Boc氨基酸衍生物共彳/b交联到树脂上，用TF A脱除B oc ,用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过De c活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或T FMSAU氟甲磺酸）法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等 .多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的 一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排

3、列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多 种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。 通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、 省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核甘酸合成等 其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展

4、望了今后的发展趋势。从1 9 63年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化竣基组分反应，接长肽链。重复（缩合一洗涤一去保护一中和及洗涤一下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中a-氨基用BOC俶丁氧段基）保护的称为BO涸相合成法，a氨基用

5、F MOC（9物甲氧段基）保护的称为 FMO C固相合成法，2 .固相合成的基本原理多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程 ，固相合成顺序一般从C端（竣基端 ）向N端（氨基端）合成过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生， 参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。 竣基端是游离的，并且在反应 之前必须活化。化学合成方法有两种 ，即Fmoc和t B oco由于F m o c比tB o c存在很多优势，现在大多采用Fmo c法合成，如图：Ki的3-XILCHTOOH +ulFnw - NIIUaLr jirfheM S Cl

6、i-WN1 IC 11CW CHr(4)rn-rfK Mt 1 (.-t* J-中X，- CHeXfls 的具体合成由下列几个循环组成:一、去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（ pipe ri din e）去 除氨基的保护基团。? 二、激活和交联：下一个氨基酸的竣基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。三、洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。2.1 树脂的选择及氨基酸的固定将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于

7、多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上， 并在以后除去；必须对合成过程中的物理 和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须 允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、竣基树脂、氨基树脂或酰脱型树脂。

8、BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merri field树脂;FMOg成法通常选择竣基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的竣基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲镂盐或钠盐、钾盐、钠盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DM SO中反应；竣基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCCM竣基二咪座,使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰脱型树脂， 却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。氨基、竣基、侧链的保护及脱除要

9、成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和竣基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护 ，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧段基类型作为a氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用正氧段基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧段基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳 定的肽类的合成。1 9 7 8年，c hang Meien 1 ofer和A th e r ton等人采用 Carp ino报道的Fmo c （9 药甲氧段基）作为a氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌咤-CH

10、2c L2或哌咤DM F脱去，近年来， Fmoc合成法得到了广泛的应用。竣基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护竣 基的常用方法，可通过皂化除去或转变为月以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；土酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链 基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-,用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪座环用2,2,2 三氟

11、1 -土氧段基和2,2, 2-三氟-1-叔丁氧段基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧 段基（Ad o c ）保护，用冷的三氟乙酸脱去。固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及竣基被保护的氨基酸放在溶 液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将竣基活化 ，变成混合酸汗、活泼酯、酰氯或用强的失 去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酊等方法来形成酰胺键。其中选用DCC HOBT HOBT/DC C的对称酸酊法、活化酯法接肽应用最广。裂解及合成肽链的纯化 BOC法用T FA+HF裂解和脱侧链保护基，FMO豉直接用TFA,有时根据条件不 同，其它碱、光

12、解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用 高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。4 .固相合成的特点及存在的主要问题固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行 可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的

13、溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。5 .固相合成的研究发展前景固相多肽合成已经有 40年的历史了，然而到现在，人们还只能合成一些较短的肽链 ，更谈不上随心所欲 地合成蛋白质了，同时合成中的试剂毒性，昂贵费用，副产物等一直都是令人头痛的问题，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展。在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这

14、种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50 %T FA脱Boc基时，有Z勺1. 4 %的肽从树脂上脱落，合成的肽越大 ，这样的丢失越严重；此外，酸催化会 引起侧链的一些副反应.Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类.1978年，Chang Meien lofer和A t h e r t on等人采用Carpi n o 3报道的Fmo c（9-药甲氧段基）基团作为a -氨基保护基， 成功地进行了多肽的F m o c固相合成.Fmoc法与Bo c法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmo c为a-氨基的保护基.侧链的保护采用T FA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA

15、T切除的对烷氧苇醇型树脂和1%证A可切除的二烷氧苇醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理.6. Fmoc-氨基酸的制备和侧链保护 ？ Fmoc基团是在有NaH COM Na 2 CO3存在的二氧六环溶液中，通过以下反应引入到氨基酸中的：,人 ?O R * J CH CXKJH J0N0 Nil CH C（K）H R -Cl. NJ理想的F moc-氨基酸的侧链保护基应在碱性条件下稳定，在酸性条件下脱除 .下面对其做一介绍.6.1 Asp 和G luA s p和Glu侧链竣基常用t Bu保护.可用TFA TMSBr等脱除.但是用t-Bu保护仍有侧链环化形成酰 亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新

16、的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保 护基可用TMSOTf（三氟甲磺酸三甲硅烷酯）除去.6.2 Se r、Th r 和 Tyrser、Thr的羟基及Ty r的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先 se r制成苇氧段基 酯，再在酸催化下与异丁烯反应. Se r和Th r还可用土基保护，S e r用苇醇引入苇基、Thr用漠正引 入土基.6.3 Asn和G1 n? Asn和G ln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时,Asn和Gln的a -竣基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氟基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的Fmoc-Gl

17、 n和Fmoc - As n在D C M中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基,2 , 4 ,6 三A 脱除.6.4? HI 1 s? H甲氧平基，4, 4一二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFi s是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护 .对咪座环的非 无-N开始用苇基（Bz 1 ）和甲基磺酰基（TOS ）保护.但这两种保护基均不太理想 .TOS 对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.B o c基团是一个较理想的保 护基，降低了咪座环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌咤

18、段基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.对咪座环 无-N保护，可以完全制消旋，无-N可以用苇氧甲基（Bom）和叔丁氧甲基（B u m）保护，（Bu m）可以用T FA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bu m是目前很有发展前途的 His侧链保 护基，其不足之处在于F mo c（His ） Bum在D C M和DM叶的溶解度较差. 6. 5 C y sCys的-SH具有强亲核性，易被酰化成硫酸，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类：一 类用TF A可脱除，如对甲苇基、对甲氧苇基和三苯甲基等；第二类可用（CF3CO）3 T1 /TFA脱

19、除，对TFA稳 定.如t- Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如苇基和叔丁硫基（stBu）等，Cys （ StB u ）可用疏基试剂和磷试剂还原,Cy s （Bz 1 ）可用Na/NH3 （1）脱保护. 6. 6 Arg? Arg的服基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个服基氮原子.保护基分四类：（1）硝基（2 ）烷氧段基（3）磺酰基（4）三苯甲基.硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧段基应主要有Boc和二金刚烷氧段基（Adoc） 2、Fmoc （Ar g ） B oc的耦联反效率不高，哌咤理时不处稳定，会发生副反应；A

20、d o c保护了两个非无-N,但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较又t脱除.近年来2 , 3 ,6-三甲基-4-甲氧苯横酰基（Mtr）较受欢迎，在TF A作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰 化发生.三苯甲基保护基可用 TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM DM叶溶解度不 好. 6.7 Ly sLys的 - NH2必须加以保护.但与 a NH2的保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去 . -N H 2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基 ，其它常用的保护基有土氧碳基和B oc. ? 6.8? Fmoc基 团的脱除Fm o

21、c基团的药环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应条件很温和.反应过程可表示如下：哌咤进攻9 -H, 0消除形成二苯药烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性不同，可根据实际条件选用.6.9耦联反应固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护的及竣基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将竣基活化，其方法是将它变成混合酸汗，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂（碳二亚胺）也可形成酰胺键，耦联反应可表示如下：（A :段基活泼试剂）碳二亚胺是常用的活化试剂，其中De c使用范围最广，其缺点是形成了不溶于

22、DCM的DCH ,过滤时又难于除尽.其他一些如二异丙基碳二亚胺 （DCI）、甲基叔丁基碳二亚胺也用于固相合成中，它们形成的月尿於、Bop（ |1 飞7 N|+ OPtNMci）, FF4 |溶于DC M中，经洗涤可以除去.其他活化试剂 ，还有Bop（Bop-CI）、氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯、SOC 1 2等.其中Dec、Bop活化形成对称酸酊、SOC 12形成酰氯，其余三种形成不对称酸酊.6.10对称酸酊法？ 用Dec形成对称酸酊的方法使用较广 .其缺点是有些氨基酸在 DCW不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酊溶解度更差.同时还有些副反应，如形成二肽、消旋等6.1 1混合酸酊法最常用试剂是氯甲酸

23、的异丙基酯和异丁基酯.前者得到的酸好稳定性好.只产生很少消旋，在适当的化学计量及溶剂条件下，耦联反应很快.而且，在此反应中使用的N -甲基吗啾和N 甲基哌咤对 Fmoc基团无影响.6?. 12酰氯法？在Boc法中不常用的酰氯，因为比较激烈，一些保护基如B oc不稳定.但是,Fmoc基团可以耐受酰氯处理，生成的Fmoc氨基酰氯也很稳定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮座/二异丙基乙二胺中，反应速度很快，消旋很少.酰氯法在固相合成中应用还不多，但已表明，Fmoc-氨基酰氯适用于合成有立体障碍的肽序列.6.1?3 活化酯法？ 活化酯法在固相合成中应用最为广泛.采用过的试剂也很多近来最常用的有 HOBt酯

24、ODhbt酯、0 TDCg旨等.HOBt酯反应快，消旋少，用碳二亚胺很容易制得;ODhb t酯很稳定，容易进行分离纯化，与HOBt酯具 有类似的反应性和消旋性能，它还有一个优越之处，在酰化时有亮黄色、耦联结束时颜色消失，有利于监测反应；OTDd旨与ODhbt酯类似，消旋化极低，易分离，酰化时伴有颜色从桔红色到黄色的变化等.6?. 14 原位法？ 将碳二亚胺和a-N保护氨基酸直接加到树脂中进行反应叫做原位法用D IC代替Dcc效果更好.其他的活化试剂还有 Bop和Bo p - C1等.原位法反应快、副反应少、易操 作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop -C1等.遗憾的是Bop酰化时生成致

25、癌的六甲基磷酰胺，限制了其应 用.6.15 裂解及侧链保护基脱除？ Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.T F A为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t B u、B oc、Adoc、Mt r等；条件温和、副反应较少.不足之处：Arg侧链的Mt r很 难脱除，TFA用量较大；无法除掉C ys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法：如用HF来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如Asp、Glu、Ser、Th r的Bz 1 （土基）保护基等，但是当脱除A sp的吸电子保 护基时，会引起环化副反应.而T MS Br和TM S 0 T f在有苯甲硫酸存在时，脱保护速度很快.此外 ，根据 条件不同，碱、光

26、解、氟离子和氢解等脱保护方法也有应用Fmos基团用于固相合成多肽已经有了十多年的历史，在合成一些含有在酸性条件下不稳定的氨基的残基的肽时，具有特别优越之处.将Fmoc法和B。c法互相补充，定会在合成更多、更大的生物分子中发挥。:、常用保护氨基酸数据缩写名称分子量残基缩写名称分子量残基A-AlaFmoc -Ala3 11.371.08M-M e tF m o c -M e t3 7 1 .5131.20R Ar gF m o c-Ar g (Pbf)6 4 8 .77155 . 18F-Ph eF mo c -P h e3 8 7.41 4 7.18N-AsnF moc-Asn (Trt)5 9

27、6. 7114.11P-ProFmoc-Pro33 7 .497.19D - As PFm o c-Asp( 0 tBu)411.461 1 5.09S - S erF m oc Ser (tBu)383.487.08C- C ysFmoc-Cys(T r t)5 85.7103 . 15T-ThrFmoc-Thr(tBu)397. 51 0 1.11Q-GlnFmoc G 1 n(T r t)610.7128.13W -Tr pFm o c Trp (B0 c)526.59186.22E-G 1uFmoc- G lu( 0 t Bu)4 2 5.4 8129.12(D) W-TrPFmoc

28、Tyr(tBu )4 5 9.5163 .18G-GlyFmoc - Gly2 9 7.357. 05D-TyrF m o c V a l3 3 9.49 9. 13H-H i sF m o c - His(Trt)619. 7137.14V-Va 1PyroG 1 u129.1I-IleFm o c-1 le3 5 3 .4113. 16pGl uL-Le uFmoc-Leu35 3 .4113 .16K-Ly sFmoc-Lys ( B oc)4 6 8.5128.18常用试剂种类及数据名称分子量名称分子量密度(g/ml)HO B t135 . 1D IPC DI(DIC)12 6. 30

29、806TBTU321. 1D I P EA (D IA)1 29. 40.76HATU380.3A c2O1 02. 11 .08DM AP1 2 2.1Pyri d ine79. 10.9 8 3HOAT136.1T FA1 1 4 .21.4 4Cl-HOB t1 6 9.5 7TM P1 21. 1 80.92HBTU3 7 9. 3E DT94.241. 123HMP A1 8 2.18TIS1 5 8 .40.773PyB o c520.4N MM101. 150.9168常见保护基团结构及数据缩写分子量缩写分子量缩写分子量Fmoc-2 2 2tBu-56Acm-5 7Pbf-25

30、 3OtBu-7 2M z 1 6 5.1T r t-242 . 3Ac-4 3B o c -10 1.1Z-1 34.1三、常用氨基酸结构及性质NameSy m bolMWMW ( H2O )StructureTh re e Let ter CodeOne LetterC odeAlanineA laA8 9.0971 . 0 8TArgin i n eArgR174.201 5 6.19J JNr.A s par a g in eA s nN13 2 .1 21 14.10H帆Asparti c A cidAspD13 3 .10115.09X广CysteineCysC121.1510 3

31、15叫Glutam i cAcidGluE147.1312 9. 12X、1yx81r叫G 1 utamin eG lnQ1 46.151 28. 1 3a业！Gl y c ineGlyG75. 0 75 7.05His t i di n eHisH155.161 3 7 .14err hl1Is ol e uci neIleI131. 171 1 3. 1 6叫Leuc i n eL euL1 3 1.1 7113. 1 6、MHaLysin eLysK146.191 2 8.1 7，j y y叫 L1MethionineM e tM14 9 .21131.20Ph e n ylalani

32、 n eP h eF165.1914 7 . 18u叫P r olineProP115 . 1397. 1 2u1Seri n eSerS10 5.0987.0 8pcr*2Threo n ineT h rT119.12101.11JrTryp tophanTrpW204. 2 318 6. 21cIH1T *Tyros i neTy rY18 1 . 1 9163. 1 8Vali n eVa lV117.1 599. 1 3四、常见保护基团结构Nam eS t r u c tureSymbolF o rmulaRes idu eWtA c etamidome t h y lA cmC 3

33、H6NO72. 1A c etylAAcC 2H3 043. 0Allyl oxy c arbon y lJAlocC 4 H 5 0 285.16Amid o h exano ateM1 yLCC 4 H 7NO85.17-Ami d o-4-me t hylcouma r y 1AMCC10H8 NO21 7 4.2a3A .1:1 .-H7 -Amido-4- t rifluoromethyl-cou ma r ylofAFCC 10H5F 3 NO2228 . 25-(2 Aminoeth y l)amino-na p ht h al e ne-1 s ul f o nic aci d

34、H9M1 iEDA NSC1 2 H13N 2O3S265.3Benz o ylB zC7H 5 O105 . 1B enzylBz 1C 7 H 791 . 1t er t B utylox y carbo n yl3BocC5H 9 O21 0 1 .1t ert- But ylthioM*1S tBuC4H 9 S89.22 -Ch 1 orobenzylox y c ar b on y l人2-Cl- ZC8H6 C lO21 69.6C yclohexylCHcHe xC6H1 18 3 .12,6- D ic h lorobe n zyl2 , 6-di- Cl- BzlC 7H

35、5 Cl21 60. 04-(4-D i methylamino p hen y l-azo)b e nzoy 1DA B CYLC15H14N3O252. 3Fi cJ .042 , 4 Dinitrophe n yl5-DnpC6H 3 N2O4167.19-Flu o renyl meth y 1VFmC14 Hl 117 9.19-Fluorenylmet hylo x y -ca r bo n y 1M uC5H 8 NO2114. 1p N itroan i 1 i d ep NAC6H5 N2O2137.12,2, 4 ,6,7-Pen t am e t h yl d ihyd

36、r o-ben z o fu r a n 5-su 1 fon y l?0J二1PbfC13H 1 70 3 s2 53 . 32 , 2, 5 , 7,8-Pentamethyl-c h roman-6-s u lf o ny 1cch3LhPm cC14H19O 3 S2 67.4Rhoda m in e 110aM1%R 1 10C 20H1 3 N2O33 29. 3Su c ci n y 1HJSucC 4 H 503101. 14 T o 1 ue n esu 1 fony 1XJL方TosC7H7O2S155.2Tri t y 1oj、TrtC 1 7H15243. 3Xa n

37、t h y l29、XanC13H 9 O18 1.2五、多肽常识R e co n stitu t i on and Storage o f P epti d esPe p tides ar e usual 1 y su p plied as a fl u f fy, f ree z e dried m a teria 1 i n s erum vials. Sto r e peptide s in af r ee z er after they ha v e be e n r ece i v e d. In o r d er to recon s titute t h e p eptide,

38、 dis t ille dwater or a buff e r s oluti on should b e u tiliz e d . Somep e p ti d es have lo w s o lubility i n wate r and must be d i sso 1 ve d i n oth e r s olve n t s such as 1 0 % acetic a c id for a posit i vely char ged pept ide o r 10% ammoniumb i carbo n a t e s olut ion f or a nega t ive

39、ly c harged pe ptide. Oth er sol v en ts thatca n be used for disso 1 v ing pe p t ides a r e ac e t on i t r ile, D MS O , DMF , or i s opro p a n ol. Us e th e minima 1 amou n t o f t he s e non-a q ueou s solvents a nd add wa t er or bu f f er t o make up the desir e d volum e . After pept ides a

40、re r e c onstituted , t h ey should be u s ed a s soo n a s pos s ible t o avoid d e grad a tion i n solut ion. Unused p e ptide shoul d be a 1 iquot e d into single u se p o rtions, r e 1 yophilize d i f poss ible, and s t o re d at -20 C. Repea ted th awing an dref reezingsho u ld be a vo i d ed.M

41、eth o ds to Dissolve P e p t i de sThebest way tod i ssol v ea pep t id e i s to use w a ter.F or pe p tides th at ar e not se inw at e r,use the f ollow i ng proc e d u re :1.Fo racidi cpeptid e s,use as mall am o u n t of basesuc has 102.3.4.Prepar1.2.3.4.5.* ThisB ioti n1.2.3.i umbicarbonatet o diss o lvet he pe p tide, dilute w i th w at e r t othedesiredc oncen t ration.For basi c pep twa