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1、ELISA操作流程（一）、基本操作流程 方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.520gml，按100ul/孔加入酶标板，4包被过夜。 2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或371-2小时，也可4封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度； 5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：
2、按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37孵育30-60min； 7. 洗板：同步骤2； 8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37孵育1小时； 9. 洗板：同步骤2； 10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应1530分钟。11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在酶
3、标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。 方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.520gml，按100ul/孔加入酶标板，4包被过夜，次日洗涤2-3次； 2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min； 3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或371-2小时，也可4封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待
4、检样品稀释致所需浓度； 5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； 6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37孵育30-60min； 7. 洗板：同步骤2； 8.加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书； 9. 洗板：同步骤2； 10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应1530分钟。 11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。 12. 结果判定：
5、裸眼观察结果或用酶标仪测OD值，有色产物的生成量抗体量。 (二) 、ELISA常用的四种方法 1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗原量。 2间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体（抗抗体）； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗体量。 3双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量抗原量。 4. 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面; 加入酶标抗原和待测抗原； 加入底物； 结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。