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1、搜风祛痰法的中药对Ang诱导人脐静脉内皮细胞NF-KBmRNA及iNOSmRNA 表达的影响 赵添成1，宫丽鸿1， 高峰2, 刘丹2, 高冬梅2,杜玉杰2 (辽宁中医药大学, 辽宁沈阳，110032)【摘要】目的：观察搜风祛痰法对血管紧张素II致体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）NF-KB mRNA及iNOSmRNA表达的影响，阐明搜风祛痰法的中药调控NF-KBmRNA与iNOSmRNA在AS过程中可能性的作用机理。方法：制备兔活心汤含药血清。采用酶消化法培养HUVECs2-3代用于实验，采用RT-PCR法测定内皮细胞NF-KBmRNA及iNOS mRNA，随机分为5组：正常对照组，An
2、g组，低浓度中药血清+Ang组 中浓度中药血清+Ang组 高浓度中药血清+Ang组。结果：活心汤可抑制Ang导致的内皮细胞损伤，减少NF-KBmRNA及iNOSmRNA的表达。结论：活心汤可抑制Ang所致的HUVECs损伤，保护血管内皮功能。【关键词】血管紧张素II；内皮细胞；NF-KB；iNOS；搜风祛痰；活心汤Effects of Expelling Wind to Eliminate Phlegm on the Expression of Vascular Endothelial Cells NF-KB mRNA and iNOSmRNA Induced by Angiotensin Z
3、HAOTIAN-CHENG1, GONG Li-hong1*,GAO Feng2,GAO Dong-mei2 ，DU Yu-jie2(Liao-ning University of Chinese Medicine,shengyang(110032),China.)Methods: The serum containing metabolic ingredients of Huoxin Decoction was taken from rabbitsHUVECs2-3 were cultured in vitro by collagenase digestive method and NF-K
4、B mRNA and iNOSmRNA were identified with RT-PCR methodHUVECs were randomly divided into five groups：normal control group，Ang II group，low concentration drug serum and Ang II group, middle concentration drug serum and Ang II group and high concentration drug serum and Ang II group.Results：Huoxin Deco
5、ction could inhibit the injury of endothelial cells and decrease the expression of NF-KB mRNA and iNOSmRNA. Conclusion：Huoxin Decoction could inhibit the injury of HUVECs induced by Angiotensin to protect vascular endothelial.Key words: Angiotensin ; endothelial cells; NF-KB mRNA；iNOSmRNA；expelling
6、wind to eliminate phlegm; Huoxin Decoction基金项目：沈阳市科技基金项目(No.1071215)作者简介：赵添成 男 辽宁省大连市人 辽宁中医药大学硕士研究生 Tel:15998285747 E-mail:通信作者：宫丽鸿 女 辽宁中医药大学附属医院主任医师 教授 医学博士 硕士研究生导师 Tel:13504052332 E-mail:.动脉粥样硬化（AS）是动脉硬化中常见而重要的一种，是心脑血管疾病的重要病理基础。受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变合并存在，包括局部有脂质和复合糖类积聚，出血和血栓形成，纤维组织增生和钙质沉着，并有动脉中层的逐渐退
7、化和钙化。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为AS【1】。AS是一种特殊的慢性炎症过程，其发生与内皮细胞损伤和功能异常密切相关【2】。近年来心脑血管疾病的发生率逐步增高，并有年轻化趋势，严重影响人类的生活质量。本实验旨在观察搜风祛痰法中药对血管紧张素诱导血管内皮细胞NF-KB mRNA及iNOSmRNA的影响，希望借此能对AS的治疗提供一定理论基础，以期指导临床用药。1 实验材料1.1药物活心汤：全蝎15g，蜈蚣2条，地龙20g，陈皮15g，半夏15g，白术15g, 水蛭15g由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2g/ml中药浓缩液4 冰箱保存备用。）1.2动物健康新
8、西兰大耳白兔（辽宁中医药大学动物实验中心）清洁级，雌雄不拘，体重2.0-2.5kg1.3 实验仪器高速冷冻离心机（Sigma 3C15K 美国）；超净工作台（苏州净化公司）；CO2恒温培养箱（THEROM HERAce11150）；倒置显微镜（OLYMPUS IX71 ）；PCR仪（Biometra Unio 型，德国）；紫外分光光度计（UV-3000，英国）；凝胶自动成像及分析系统（Chemi Imager 5500，美国）。1.4 所需制剂Ang（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；DMEM（美国gibco公司 ）；PCR引物（北京华大基因公司合成）；胎牛血清（天津市灏洋生物
9、制品科技有限责任公司）2 实验方法2.1 药物血清的制备随机将兔分为四组：低剂量组（n=5）中剂量组（n=5）高剂量组（n=5）分别灌胃给以活心汤，以人临床用量动物等效计量比值血清稀释度为参考给药量，空白对照组（n=5）给等容积的蒸馏水，连续5天，第5天灌胃后2h（灌药前禁食12h,不禁水）颈动脉放血，分离血清，5630min灭活，低温干燥，置-80并向中保存备用，临用时用DMEM培养液配成10mg/ml的浓度，再用0.22m的微孔滤膜过滤除菌。2.2 HUVEC培养及鉴定人脐静脉内皮细胞的传代：原代培养的人脐静脉内皮细胞生长至80%以上汇合时，倒出培养液后用PBS液冲洗两次，然后加入少量的0
10、.2%胰蛋白酶进行消化，约2分钟后在倒置显微镜下观察，见细胞皱缩、彼此分离或出现大片分离即表明内皮细胞以脱壁，随即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，以终止消化，并用吸管反复吹打瓶壁，制成细胞悬液，用计数板计数后，按1105个/ml分装在25cm2培养瓶中继养。 2.3 实验分组随机分5组：正常对照组（空白血清）； Ang组（0.5mol/L）组；低浓度中药血清+Ang组：0.5mol/L Ang+2.5%中药血清；中浓度中药血清+Ang组：0.5mol/L Ang+5%中药血清；高浓度中药血清+Ang组：0.5mol/L Ang+10%中药血清。用中药血清事先孵育2h后再加入Ang0.5m
11、ol/L刺激2h，收集细胞。2.4 RT-PCR法测定内皮细胞NF-KBmRNA及iNOSmRNA采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定纯度并定量。根据中国医科大学提供的NF-KB及iNOS和内参照-actin的mRNA序列，应用软件Primer Premier5.0自行设计引物。序列如下：引物 上游引物 下游引物 扩增长度NF-KB 5-GCCGAAAGACCTATCCC-3 5-CTCATAGAACCGAACCTCAA-3 575bpiNOS 5-GGAAGCGGTAACAAAGGA-3 5-GCCAGCATAGCGGATG-3 310bp-actin 5-AAAT
12、CGGCGTGACATTAA-3 5-CTCGTCATACTCCTGCTTC-3 472bp 反应条件：94 5min，1个循环；94 30s，59 30s，72 1min，35个循环；72 5min后结束扩增反应。取5lPCR产物与2l Lodding Buffer混合，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V 1.5小时，电泳结束后，凝胶成像仪成像分析。2.5统计学处理：SPSS12.0软件，所有数据均以s，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，相关分析采用直线相关。检验水准=0.05，P0.05有统计学差异。3结果RT-PCR结果量化分析：采用FlourChem V 2.0凝胶成像分析软
13、件（America）分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析. 3.1活心汤对血管紧张素II诱导血管内皮细胞NF-KB mRNA表达的影响正常对照组的NF-KB mRNA表达最低，AngII组的NF-KB mRNA表达明显高于其它4组（P0.05）。三个中药血清组NF-KBmRNA表达比AngII组显著降低（P0.05），与低浓度组中药血清相比，中高浓度中药血清组抑制NF-KBmRNA表达更加明显（P0.05）。结果见图1及表1 M 1 2 3 4 5 图1血管内皮细胞NF-KB mRNA表达 表1 注：M- Mark；1-正常对照组；2-AngII组；3- 低浓度组;4-中浓度组；5-
14、高浓度组。3.2活心汤对血管紧张素II诱导血管内皮细胞iNOSmRNA表达的影响。正常对照组的iNOSmRNA表达最低，AngII组的iNOSmRNA表达明显高于其它4组（P0.05）。三个中药血清组iNOSmRNA表达比AngII组显著降低（P0.05），与低浓度组中药血清相比，中高浓度中药血清组抑制iNOSmRNA表达更加明显（P0.05）。见表2及图2。 表2 图2 AngII及不同浓度中药刺激后iNOSmRNA的表达 注：M-Marker，1 空白组，2AngII组，3低浓度中药组，4中浓度中药组，5高浓度中药组，-actin为内参。4讨论动脉粥样硬化斑块形成是一个复杂过程，开始于内皮
15、功能障碍，这种功能障碍包括内皮对脂蛋白等的通透性增加，随后是血管平滑肌迁移、T细胞活化、泡沫细胞形成、血小板粘附聚集【3】。而且，在AS 这种炎症一增殖性疾病的病变部位，血管平滑肌、血管内皮细胞、巨噬细胞内均有 NF一KB激活现象，由此而引发细胞粘附、炎性细胞趋化、细胞分化和细胞外基质降解，参与并促进AS 的进展【4】。NF-KB是一种基因多显性转录因子，它控制着细胞粘附分子、细胞因子、生长因子和凝血系统一些成分的基因表达【5】,其活化与炎症反应、动脉粥样硬化等疾病密切相关【6】。核转录因子NFKB是众多信号传导环节的汇聚点。而且作为炎症通道重要转录因子，可介导致炎因子细胞因子、粘附分子和单核
16、细胞趋化蛋白的高效表达，在动脉粥样硬化早期炎症病变形成和发展过程中发挥着重要作用，是目前筛选中药复方中最有潜力抗炎靶点【7】。NO是炎症介质之一。所有血管要发挥正常功能需NO达到基础水平，但NO产生过量，则会介导炎症反应。NO的过量产生依赖于iNOS mRNA的异常表达。机体对NO不同作用的调节，是通过调节不同NOSmRNA亚型的表达，从而产生不同的NOS亚型来实现的，NOS包括iNOS和构成型一氧化氮合(cNOS)，cNOS又包括内皮型NOS(eNOS)和神经型NOS(nNOS)。而iNOS多存在于各种器官的巨噬细胞Kipffer细胞中，其他类型的细胞也有少量存在。iNOSmRNA来源的NO
17、作用以细胞毒性为主【8】。细胞毒素如脂多糖、细胞因子等都能激活iNOS，生成比正常多1 000倍【9】。 iN0SmRNA半衰期比较长，一旦被激活可持续长时间翻译合成iNOS【10】，而iNOS一旦被诱导合成即可持续产生大量NO，直至底物耗尽【11】。动脉粥样硬化在中医学上无此病名，根据本病的临床表现及病理变化，本病可归属于“中风”、“胸痹”、“脱疽”等病症的范畴，临床以胸痹心痛为常见病症之一。胸痹心痛首见于黄帝内经，灵枢本脏云：“肺大则多饮，善病胸痹。”指出痰饮阻痹胸中是胸痹的主要病机【12】。随着生活质量的提高，过食肥甘冷饮、嗜好烟酒而内生痰浊，导致淤阻心脉而发生胸痹的患者日益增多，而痰浊
18、又能使LDL升高。Ang II可以使血管收缩引起血淤，而中医有津血同源理论，且津停为痰，又认为久病入络，宜搜风通络祛痰，治血与治风相通，从痰从风论治。本实验所运用方剂活心汤是宫丽鸿主任医师根据多年临床经验总结而来。方中全蝎熄风止痉，解毒散结；蜈蚣熄风止痉，解毒散结，通络止痛；地龙清热熄风，平喘通络止痉，共为君药；陈皮、半夏、白术合用，既能燥湿化痰，又可宽胸理气，消痞散结，为臣药；水蛭为虫类化瘀药，破血逐瘀而不伤新血，为佐药。合方共奏搜风祛痰，祛瘀通络之功效。现代药理研究显示：全蝎有增加心肌收缩力作用，能抗血栓、形成扩张血管、降低血压的作用；蜈蚣有抗心肌缺血、加强心肌收缩力和扩血管的作用；地龙有
19、激活纤维酶原作用；陈皮能抑制血小板聚集，能降低血脂、预防动脉硬化及抗血也高凝状态作用；水蛭能抑制血栓形成，降低血流粘稠度及降血脂，上药合用，能有效防止动脉粥样硬化的形成。本实验用Ang刺激人脐静脉内皮细胞后观察到iNOSmRNA和NF-KB mRNA表达升高，表明实验模型成立。本实验用搜风祛痰法中药活心汤含药血清进行实验干预，可明显抑制Ang诱导的细胞损伤，降低内皮细胞iNOSmRNA及NF-KBmRNA的表达，改善内皮细胞功能，减轻内皮损伤，说明中药对预防和治疗AS有一定疗效，亦为临床在中西医结合治疗AS提供了可靠的理论依据，但其作用和机制还不全面和深入，还有待进一步研究和探讨。参考文献1
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