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1、实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术 指导教师：张建丽 姓名：高熹 学号：1120152430 细菌鉴定中常用的理化生化反应一、实验目的1)了解细菌生理生化反应原理2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。二、实验原理1）糖（醇）类发酵实验因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来
2、判断。2）甲基红（Methyl red）实验（MR实验）大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色 。产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上, 故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。 3）伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验)4）靛基质(吲哚)实验大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。5）硫化氢实验某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形
3、成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验。6）明胶液化实验某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性。7）淀粉水解实验细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色。8）柠檬酸盐利用实验产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐, 培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色. 三、实验试剂及器材实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌平皿
4、、杜氏小管、接种环,酒精灯；微生物材料：大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面；试剂：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂 格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液；培养基：葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验）葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验）胰蛋白水培养基（吲哚实验）柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验）明胶培养基（明胶液化实验）淀粉培养基（淀粉水解实验）柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验）硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）。四、实验步骤1）糖（醇）类发酵实验1. 编号： 在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号.2. 接种： 取3 支葡萄糖发酵培养基, 1 支接种大肠杆菌，1
5、支接种变形杆菌,留1 支不接种，作为对照.3. 乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37培养箱中培养24h.4. 结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH 降低, 培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。2）甲基红实验（MR 实验）1. 取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。2. 取1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌,1 支不接种，作为对照。37培养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果。3. 结果：呈现
6、红色者为阳性, 呈现黄色者为阴性。3）伏-普实验(V.P.实验)取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1支留作对照。37培养48h 取出,加入40% KOH 5-10 滴,然后再加入等量的5%-萘酚溶液,用力振荡,再放入37培养箱中保温15-30min 加快反应速度.若培养物呈现红色,为伏-普反应阳性。4）靛基质(吲哚)实验取3 支胰蛋白胨水培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1 支留作对照。37培养24-48h 后, 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面, 观察结果.呈现玫瑰红色为阳性,不变色为阴性。5）硫化氢实验取3 支醋酸铁或柠檬酸铁半固体培养
7、基，采用穿刺接种法，1 支接种大肠杆菌，1 支接种变形杆,1 支作对照。37培养24h 观察结果,若有黑色沉淀线出现为阳性。6）明胶液化实验取3 支营养明胶培养基，用穿刺接种方法，1 支接种大肠杆菌，1 支接种枯草杆菌，1 支作对照。37培养48h 后，将明胶培养基轻轻放入4冰箱30 min,观察明胶的液化情况。若明胶不凝固者，表明其已被细菌液化,是为阳性结果。7）淀粉水解实验1. 将冷却到50的淀粉培养基以无菌操作制成平板。2. 用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边,再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。3. 置37温箱培养24h。4. 打开培养皿, 将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻
8、轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板.如菌苔有透明圈出现,表明淀粉已被水解.透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的大小。8）柠檬酸盐利用实验取3 支柠檬酸盐斜面培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1 支作对照。37培养24 h 观察结果.培养基变深蓝色者为阳性.培养基不变色,则继续培养5-7 天,培养基仍不变色者为阴性。9）硝酸盐还原实验取3 支硝酸盐培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种枯草杆菌，1 支作对照。37培养18-96h,每天吸取培养物2ml 加格里斯试剂A 液和B 液1 滴,出现粉红色,玫瑰色,橙色或棕色为阳性.如无阳性反应,可加入1-2 滴二苯胺试剂,如培养液呈蓝色,则表示
9、培养液中仍有硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其它物质,仍按硝酸盐还原阳性处理。五、实验结果及分析（一）糖（醇）类发酵实验：37培养24h，葡萄糖（图一）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：产酸产气。乳糖（图二）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：无明显变化图一 图二 图三 图四（二）甲基红实验（图三）：37培养48h，加甲基红指示剂数滴，大肠杆菌：红色（阳性）；产气杆菌：黄色（阴性）（三）V.P.实验（图四）：37培养48 h取出,加入40% KOH 5-10滴,然后再加入等量的5%-萘酚溶液
10、,用力振荡,再放入37培养箱中保温15-30min。产气杆菌：培养物呈现红色（阳性）；大肠杆菌：无明显变化（阴性）（四）靛基质(吲哚)实验（图五）：37培养24-48h后, 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面。大肠杆菌：呈现浅红色；产气杆菌：呈现浅红色。 图五 图六 图七 （五）硫化氢实验（图六）：37培养24h，变形杆菌：有黑色沉淀出现（阳性）；大肠杆菌：无明显变化（阴性）。（六）明胶液化实验（图七）：37培养48h后, 将明胶培养基轻轻放入4冰箱30 min,观察明胶的液化情况。枯草芽孢杆菌：明胶液化（阳性）；大肠杆菌：明胶不液化（阴性）（七）淀粉水解实验（图八）：37温箱培养24h，打
11、开平皿, 将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌周围都有透明圈出现，枯草杆菌周围透明圈大于大肠杆菌周围透明圈，证明枯草芽孢杆菌水解淀粉能力更强。（八）柠檬酸盐利用实验（图九）：37培养24 h，产气杆菌：培养基变深蓝色（阳性）；大肠杆菌：培养基不变色（阴性） 图八 图九 图十 图十一（九）硝酸盐还原实验：37培养18-96h,每天吸取培养物2ml加格里斯试剂A液和B液1滴。24h后（图十）：大肠杆菌和枯草杆菌加入试剂后均呈现橙色（阳性）；48h后（图十一）：大肠杆菌和枯草杆菌加入试剂后均呈现橙色（阳性）六、注意事项1.实验时,同时以未接种细菌的培
12、养基作对照.因为亚硝酸盐在自然界分布很广,容易污染试剂.另外,硝酸盐不纯或保管不妥,也可能含有亚硝酸盐。2.繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌,如果培养时间过久,可能将亚硝酸盐全部分解成为氨气和氮气,这样可出现假阳性反应,故须每天进行实验。七、思考题1、在吲哚实验和硫化氢实验中细菌各分解何种氨基酸?吲哚实验：细菌分解色氨酸。因为某些细菌含有色氨酸酶，能将色氨酸分解成吲哚，加入吲哚试剂后起颜色反应。硫化氢试验：某些细菌能够分解含硫氨基酸，包括胱氨酸和半胱氨酸搜索，产生硫化氢，加入含铁或铅的试剂后起颜色反应。2、说明硝酸盐还原实验对细菌的生理意义及对农业生产的影响?有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等，因此可以具备部分替代氮肥的能力。八、实验反思 实验结束后，应隔一段时间观察结果，不能时间太长，比如划线两天后才观察，已经长成了菌苔。