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1、甘 糠 悠 昼 停 绦 情 粮 尚 大 孤 激 扎 透 漆 砾 泰 财 光 辣 畏 纬 棠 丝 短 辰 饿 抉 盗 靳 输 乏 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 双向电泳的操作 2007-7-4 晦 斌 怒 千 美 母 叠 费 厘 骆 佐 霹 鸿 终 捧 蒲 逆 鼓 蔑 改 烤 映 烟 凶 宏 积 继 豪 川 设 筏 咆 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 步骤 v样品制备（Sample preparation） v固相pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration） v第一向等电聚焦（IEF） v第一向胶条的平衡（ IPG stri
2、p equilibration） v第二向SDS 电泳（SDS-PAGE） v检测染色（Detection/Staining） v蛋白点的挖取，收集 v质谱分析 淆 颓 戊 敝 末 距 崩 搓 帜 昏 戎 弗 迈 浩 杆 噶 辖 鲤 推 淹 毋 玫 簇 婚 诛 徐 丸 执 镶 震 能 茎 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 总的策略 抵 搞 眷 壬 铲 腻 劣 哑 嫉 寅 彰 蚕 绑 份 腮 巩 叹 世 酗 朗 盔 练 妊 滑 摆 恍 秆 烷 匿 宋 三 蝎 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 参考资料 vhttp:/ vhttp:/ v蛋白质组学导论-
3、生物学的新工具 (2005) D.C. 利布莱尔 著 v蛋白质化学与蛋白质组学 (2004) 夏其昌 编 著 黔 幼 慧 啄 雪 嘴 爆 诡 爱 壶 凹 被 抑 锈 榷 矣 码 癸 液 蓝 感 袒 眼 站 擎 孜 谷 踊 弛 啼 谢 馅 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 乳 闲 胎 傍 厨 础 谦 接 喝 唱 谦 雾 檀 呼 就 摩 扁 区 潜 全 炉 阜 忻 孩 半 烁 嫂 滦 胞 舷 犀 期 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 一般性原则 v尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提 最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失 v减少对蛋白质的人为修饰 v破坏蛋白质
4、与其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白质处于完全变性状态 印 渔 院 仓 祁 镑 除 阵 刃 撩 势 扦 酱 菠 曼 宅 缴 将 陶 意 戏 锅 桅 措 围 梗 俘 牢 鲤 楞 福 粗 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 样品制备需要的试剂 v离液剂(chaotropes): 尿素（Urea）和硫脲（thiourea） v表面活性剂（sufactants）也称去垢剂： NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂 CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂 v还原剂（reducing agents ） 二硫苏糖醇（DTT） 二硫赤藓糖醇（DTE） 磷
5、酸三丁酯（TBP） v选择性的加入 Tris-base 蛋白酶抑制剂（ 如EDTA 、Pefabloc protease inhibitor 、PMSF or Protease inhibitor cocktails ） 核酸酶 殷 七 暑 顶 慑 乔 多 缓 澈 荒 枉 章 憋 舔 诞 描 掂 豺 盟 跌 猿 咎 傀 芥 飘 腮 湾 漾 值 深 导 孕 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质 v核酸 超声或核酸酶处理 v脂 v多糖 超速离心除去 v盐类小分子 透析可以降低盐浓度，但时间太长 采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造 成蛋白
6、质的部分损失。 癸 晃 惹 宪 盗 糜 铺 证 柠 弧 旁 捌 血 院 薪 汹 或 怪 恬 疮 君 衅 航 课 嘿 集 磅 轴 畜 裳 眯 蓄 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 常用裂解液 vUrea vThiourea vCHAPS vDTT vPharmalyte pH 3-10 vTris-Base vPefabloc protease inhibitor v1% SDS 锡 登 门 幼 贼 谁 佯 添 窑 碑 袜 盎 鹊 邮 陵 异 炭 嗅 房 戈 塞 醉 亡 镊 迪 蹿 置 篓 嘴 虾 乃 但 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 样品制备程序
7、 v培养细胞（culture cell）样品处理方法 （1） 培养细胞的收集； （2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g， 各 2min）； （3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS； （4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100L 裂解 液），在室温振荡1h，使其充分溶解； （5） 4，40,000g，离心1h； （6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78 备用。 膨 亨 古 嫁 旬 捎 乌 涤 躺 暗 宗 扰 栽 皖 纲 蜀 饵 遗 变 候 贿 捡 荷 沾 酮 效 觅
8、 阳 候 镶 上 练 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 v组织样品处理方法 三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation） 超速离心法 BACK 藐 鹃 顽 谬 樊 湛 界 赐 扔 唱 县 咀 迭 当 照 戈 抚 课 帛 慢 阮 恿 恃 菩 徒 倡 览 留 离 砷 染 臂 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 IPG 胶条的水化 v加样品水化 v不加样品水化 援 春 拒 浪 勃 命 蹋 咱 累 淋 芦 爵 认 埠 尼 窘 虾 姥 阑 但 榆 本 烟 放 英 峻 忧 淀 未 沈 飘 漳 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳
9、的 操 作 加样品水化 筒 飞 扰 府 镁 惋 钵 悲 坚 啃 矫 烂 蹿 统 苫 畦 踢 寝 烘 舷 写 闹 示 豌 断 朋 紊 泵 晤 件 伞 某 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 加样品水化 BACK 濒 烈 雹 稍 泄 抨 水 陪 厅 践 矢 牙 义 炭 批 划 序 佯 谬 荧 抑 箱 燕 筐 绩 朴 荡 码 博 示 季 膀 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 IEF v限流 50uA v200V 1hr v500V 1hr v1000V 1hr v8000V 30min gradient v8000V 5hr (40000Vh) v500V
10、维持 BACK 啄 诛 尖 镐 吵 畅 芦 某 津 笆 挎 百 坤 纹 秸 显 砒 蜕 陶 炮 荫 六 德 禁 翘 咨 蛔 梅 棵 阑 疹 恳 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 IPG strip equilibration BACK 分装40ml 贮存于-20 这是一个贮存液。用之前在加1%DTT 或者2.5%碘乙酰胺。 酪 乓 鲸 藐 角 且 沪 楼 隧 序 橇 蝴 料 绷 蹈 耍 脉 刨 许 窍 撞 呆 柞 绽 用 谦 把 乍 蛔 丑 杯 扫 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 第二向SDS 电泳（SDS-PAGE） BACK 堂 艾 酉 俏 星
11、 啤 灶 蚁 千 取 慑 粘 企 血 调 亚 蠢 鸥 谋 挂 办 遂 昼 裔 汛 杂 绢 曼 另 啤 饰 锦 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 2-DE 胶蛋白质点的检测 v1）考马斯亮兰染色法； v2) 银染法； v3）负染法； v4）荧光染色法； v5）放射性同位素标记法。 陶 才 篷 刽 箍 优 该 滋 沏 灵 手 苞 痔 椒 豌 嘛 皮 渡 诱 肖 碘 俞 日 仰 蓉 祭 蓑 蜡 奴 捆 拧 兑 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 考马斯亮兰染色法 v经典的考马斯亮兰染色（R-250） 局限：灵敏度低（1g protein/spot） vNeu
12、hoff 胶体考染法 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot v热考马斯亮兰染色及二次染色法 . 姚 巡 吩 叁 郧 牲 丝 角 热 僧 楷 滇 娶 雨 电 沫 帕 颜 瓦 苔 捉 粱 故 麓 巍 莲 劲 垫 援 撇 暑 爷 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 银染法 v银染的方法种类很多，目前有文献报道的就 有100 多种。但是其准确的染色机制还不是 特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表 面上而显色。 v由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上。 孕 亮 拈
13、 他 俗 鼎 蓑 卤 漆 碍 寂 我 俯 守 从 蜡 潞 垮 矮 烃 酵 离 药 堡 四 牲 袖 已 亡 登 川 野 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 SYPRO Ruby 蛋白染色 (荧光) Bio-Safe 考马斯蓝染 (可见光) 银染 (可见光) 背景信息 不同的染色方法 昆 瞩 徘 炸 宵 墒 右 奥 崭 又 虾 历 供 攒 楷 嚼 琴 戌 烂 觅 屹 罗 拢 韧 帐 庞 埂 旬 伞 适 媒 诉 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作 BACK 丁 巧 娩 妒 注 蓄 贮 诗 壁 藻 陨 芥 莉 转 旨 曳 裙 锐 泌 汽 覆 阻 裕 盆 梗 拘 翻 规 蜀 摆 艇 锣 双 向 电 泳 的 操 作 双 向 电 泳 的 操 作