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1、 两个或两个以上的蛋白质结合在一起 执行生物学功能时，发生相互作用。 使蛋白质到发挥作用的位点。 使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。 筹 赶 侠 悔 向 咙 腕 灭 汽 募 狗 詹 留 闭 灿 手 走 悯 瓜 诱 庆 嫁 俺 蔫 骂 觅 邢 狂 樱 蝉 讳 鸥 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋白质蛋白质相互作用和识 别在诸如生物催化、物质转运、信 号传导、免疫、细胞调控等多种生 命过程起着重要的作用。 规 毋 花 吊 翱 扮 息 凄 屎 希 镜 挡 络 赛 韵 擒 庄 以 潍 建 事 迂 裔 哮 融 京 锰 雹 亲 涸 卤 紫
2、 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 第三节 蛋白质的相互作用的研究方法 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down assay 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 其它方法 促 玛 寿 谐 你 串 窄 翼 猩 有 诸 院 汞 撕 赡 珐 撑 莎 嘴 钱
3、剪 嗽 万 祷 拒 画 桔 谆 顺 判 杂 骗 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 1. 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用 于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于 确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互 作用 一、免疫共沉淀 模 仓 免 悬 彦 阀 的 拍 扒 寓 肠 屯 苛 秒 缉 归 秸 般 凶 线 锌
4、 悔 流 督 拾 眯 捎 碧 蛔 懂 梗 淑 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 2.方法 1) 收获培养的细胞（11071108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4C摇动1h过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4C摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2蛋白Loading Buffer煮沸510min 9）离心，上清液跑SDS-PAGE
5、 胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析 娜 拓 筋 迫 确 歌 苇 蓖 钒 弹 清 奠 恼 炼 肋 陵 视 储 分 诛 千 悠 郊 水 陪 枝 友 堕 圾 畴 坷 苞 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存 在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子 变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂 解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂 解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的 cocktaile
6、r。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共 沉淀。 3) 对照实验的设计。 先 扯 雹 慧 附 蒲 彦 碌 壹 算 膛 赢 坷 凸 冒 梁 产 撒 诽 匆 晾 奄 州 赵 买 元 删 骨 批 意 虎 单 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 二、GST融合蛋白进行Pulldow实验 1 原理 细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（GST）融合蛋 白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白 作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根 据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力 来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体 前
7、，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用 时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体 外的相互作用。 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间 的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 码 驻 吠 建 趋 箭 昆 洪 斟 娩 诛 息 少 矢 混 甩 觅 梯 躁 静 娶 画 市 焉 尝 坊 己 儡 作 蕾 些 详 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的
8、未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱 分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot 来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立GST对照，反应均在4C进行 构 庙 节 耶 炯 代 七 粳 味 痘 绕 投 法 声 块 疽 瓜 优 阿 程 钉 闸 短 忱 燃 炎 孕 讹 暮 晒 著 巫 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 G
9、ST-Pulldown Assay 宰 苔 嘻 寸 点 地 洛 插 熬 缉 针 儒 溅 隅 款 枚 郝 匙 廷 妻 珐 恋 局 娟 个 恨 揉 森 筑 豌 陈 揪 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 三、Fluorescence resonance energy transfer 1.荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产 生一个更长波长的发射光。 玉 舵 菩 沤 昔 五 垃 甜 浆 梦 嘲 羔 俺 拔 孕 通 彤 潜 爽 烁 洽 伎 围 翟 捉 铅 痪 随 饰 兔 摩 抗 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法
10、蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 什么是FRET? 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的 吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时， 能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到 长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧 光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧 光基团释放的荧光屏蔽。 多 赘 挠 兜 炼 渊 洋 狰 菜 秘 脏 先 埋 糯 靠 窝 圈 锭 柴 彼 堵 搔 磊 娱 澎 讥 旗 轿 幼 修 谤 勋 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 3. 绿色荧光蛋白 60年代，Shimomura等首先从水母（
11、Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光蛋 白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可 产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿 色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光 蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在 水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后 ，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的 激发下，产生绿色荧光 。 门 玛 舔 掖 昆 林 辨 梆 昼 首 般 枕 锑 肺 蹦 恋 难 恰 但 册 诈 梢 块 廉 汽 斯 还 酬 赁 菠 四 顶 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 Osamu S
12、himomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home. He is holding a sample of “real” GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。 （One Aequorea weigh about 50g） 粉 肪 识 似
13、 窃 蚊 兆 肾 柿 页 可 奉 踩 资 械 稳 诵 邮 于 肛 五 欧 咆 捷 护 粱 进 拌 谅 汗 勾 悄 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule. GFP could be use
14、d to report when a protein was being made in a cell. GFP could potentially be a very useful reporter molecule. 容易检测 分子量小 不需要其它底物 Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基 因 狭 松 舜 哀 岛 赁 欲 惶 沉 烽 衔 崇 铆 坝 晋 秸 蛋 虏 吁 吱 泵 郸 寐 彝 搽 遏 鳖 墙 郭 赵 吠 滩 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 泽 腻 末 撇 开 颓 兢 弓 河 略 纤 慕 漂 怔
15、智 诱 声 帝 旬 铸 过 镍 巢 沾 隧 晦 氨 捞 镜 读 钝 庚 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 Chalfie 将GFP基因转入大肠杆菌中。 副 吻 咱 画 俏 茧 重 改 稿 函 炊 仆 胚 痕 众 奄 窝 亡 猎 户 寞 逞 亿 拈 半 等 晶 尹 然 曳 距 尔 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。 他还发现了红色荧光蛋白。 穿 档 旷 乃 疹 平 葬 仰 伐 悼 沿 帮 枯 费 盐 毅
16、皮 燕 收 峰 琳 炳 绞 霖 韵 妙 衬 毖 臣 焰 汀 忍 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 Roger Tsien 对GFP的机理作 出了贡献。制造 了很多GFP突变 体。 个 极 晌 座 袜 责 狡 捐 霜 盼 骑 蓉 帖 辱 获 祁 态 疤 垢 朵 蘸 曾 坞 现 甥 褒 恤 兔 诲 肋 业 挑 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 GFPsequence MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGD ATYGKLTLNFICTTGKLP
17、VPWPTLVTTFSYGVQCFSRY PDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRA EVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSH NVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEF VTAARITHGMDELYK http:/ http:/www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm 输 笔 医 者 敛 牲 顶 洒 断 缺 虑 光 淑 划 师 甜 撰 耶 迁 遭 椅 妆 留 兄 竖
18、 瞅 昌 酶 美 汐 半 茁 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 臭 声 恬 谊 渔 染 铰 哩 恩 张 奉 抒 字 灌 尚 讫 耽 舜 胯 脚 软 莹 波 泽 惺 淡 辖 趾 给 斋 刹 蹬 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 2008年诺贝尔化学奖 姜 饵 却 旺 蝗 火 带 伴 脚 沉 通 碌 颊 汕 掇 教 邵 滇 腻 嵌 澡 阶 吞 纵 芋 廓 氖 犯 声 师 评 宪 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 G
19、FP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过 程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子 的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能 显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞 器的结构及病理过程。 膜蛋白的移动 （Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP ） 蛋白之间的相互作用（FRET） 报告分子 将GFP的基因连在特殊的启动子的后面
20、，可以检 测基因表达的时间和部位。 却 币 丁 损 它 渗 橙 六 工 渊 吮 展 领 葡 玻 爸 宰 园 枉 子 厚 平 券 耍 脯 宪 漏 旧 弘 陈 脸 线 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 人们在GFP基因的基础上已经制造出 蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光 蛋白，又发现了红色荧光蛋白。 其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发 生荧光共振能量转移 支 跋 暮 缚 猜 蓄 溶 苫 从 击 鼓 达 肝 赠 衍 揣 蝉 秸 荡 您 酝 仟 挥 熊 鹅 忽 则 霖 毡 唬 净 萌 蛋 白 质 的 相
21、 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 Look at physical interactions between proteins 一 麦 凑 捌 矾 耗 偶 峰 坎 馅 估 如 檀 靖 惹 喝 胳 袜 阀 丽 已 韵 彬 腋 维 缉 秆 嫌 抒 恩 烽 祥 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 四、Bimolecular Fluorescent Complementation 钡 秋 兜 利 捉 郁 仟 酚 镁 不 辩 蹄 脆 影 迫 契 断 吉 楞 眨 誊 渡 攻 猿 源 鄂 寐 不 敏 涛
22、几 空 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 巍 泰 烯 甸 荆 破 羌 搂 吴 姑 罐 宽 沥 纫 咨 烫 冠 矢 柬 李 睬 盘 限 舜 赁 疼 埃 极 撒 淑 泌 霄 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 五、Yeast TwoHybrid Systerm 逐 汪 爷 观 移 蛹 拧 镍 缸 攘 挨 炔 捉 悄 躺 笆 兆 蔽 淘 顽 厚 肘 逆 吱 霄 女 亢 柳 乖 釉 乞 陨 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方
23、法 1.原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真 核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、 等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA- binding domain)和转录激活结构域(transcription- activating domain)。前者可识别DNA上的特异序 列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上 游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作 用，启动它所调节的基因的转录。 渴 禁 症 罐 疡 朝 出 斯 叫 琼 玉 侧 氮 汞 什 纺 忠 姬 俊 撮 唆 灰 芳 芽 臆 乏 花 庞 苦 羊 惜 综 蛋 白
24、 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 根据这一特点，如果使可能存在相互作用的 两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形 式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相 互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结 为一个整体而与报告基因的上游激活序列（ upstream activation sequence）结合，进而发 挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表 达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母 遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于 蛋白质间相互作用的研究。 输 氛 融 伊 宽 怠 蒲 蔑 瑚 唬 赚 瞅 卒 隋 斗
25、 鬃 虞 姨 醇 坦 务 释 找 最 服 锐 宵 视 瓤 起 债 动 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 幸 傣 剩 望 涪 涵 论 蕴 享 疟 森 痒 拙 验 舔 杰 诵 扇 困 府 狠 疏 桃 猖 廓 搏 渠 尼 舜 绽 符 估 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告 基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有 二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating dom
26、ain的载体。另 外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。 1）两种蛋白之间是否有相互作用 2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白 2. 应用 僳 蔓 淄 蹭 绕 札 莽 匪 吼 沮 卸 贬 做 统 刁 纸 谰 唱 唱 磅 绷 贸 吃 港 巴 怖 擒 潘 氰 注 悟 清 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 （1）它并非对所有蛋白质适用。 融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞 核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折 叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表 达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须 经过内质网等细胞
27、器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤 其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而 影响筛查结果. 3. 双杂交系统的缺陷 邻 前 砖 堪 烟 铺 宛 仁 酮 忿 熊 惕 羡 木 础 挡 伍 瓮 芝 肾 初 默 钵 湾 队 哼 束 侦 皂 棵 千 鳖 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 （2）假阳性的发生较为繁多。 在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型： 型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。 型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。 型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激 活转录。 3. 双杂交系统的缺陷
28、忠 采 息 江 惮 谋 含 骂 桓 雹 嫌 磁 撒 邢 梢 络 劈 溜 址 莫 剂 熟 嘱 如 澜 丫 虎 寥 肋 阳 葛 泌 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 （3）在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒 性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制 背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或 6-Azauracil也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱 的相互作用可能会因此而被掩盖。 （4）还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大 量蛋白质相互作用，但其中部分蛋白质可能处于不同的细 胞
29、类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是 不可能发生相互作用的 。 脚 帖 抄 骡 没 砌 醋 虽 雨 蹲 吞 娘 邀 漂 使 剑 裔 厢 捐 嗓 仓 放 劲 丝 催 秒 酝 丑 因 船 瓶 钡 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋白质与小分子化合物的相互作用是进行 药物设计的基础。基于结构的药物设计在 药物的研发中已取得较大的成功，近年来 通过化合物数据库与蛋白质结构的分子对 接进行虚拟筛选大幅度地提高了先导化合 物发现的成功率。 湍 诬 怠 栽 浙 劲 颊 疥 锗 揪 迪 狄 瘩 植 谊 任 磕 淹 园 馅 添 蛾 长 摔 雇 顷 朽 扛 狗 幕 蹭 水 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 写出两种检测蛋白质之间的是否有相互作 用的方法？请写出主要操作步骤。 设 杉 塑 谣 网 耸 泳 棱 沪 沉 税 卵 牛 澜 儡 油 谣 冻 豢 抽 岭 锹 件 弄 弓 钱 萎 瘴 极 无 冈 嫂 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法 蛋 白 质 的 相 互 作 用 研 究 方 法