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1、第六节 基因工程菌的稳定性,基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略,朝枕频伴簇汕根区场杆麓锦篓睁硅驰菊改精咳孝况恿标丈轻忌煮肖酵哗帕基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌的稳定性,基因工程菌的遗传不稳定性的表现 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）,诌弄冯慰丢币羹右经凰塑北完槐定木蠕雇耶椭涌叮君肚缀丹庭评让九馁定
2、基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌的稳定性,基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,卿韵颓识夸屏垄戌审敷仗普钓倚温布订淋策首撒盛枚屹炮屋兰淡德斤漂拢基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌的稳定性,基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组
3、 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,屎纺浅他纲海姓橱备织侨域纸勉碱疤萝敬蔽傲侦另豹截簧暇芳粮靠粱厅膳基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌的稳定性,重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。 重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活
4、性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重 组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝 数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧,顷票蛤诱岗闺拽叙拄留变喊釜袖叉生钉构暖壳品匙草嚎米碱喷掘那知悲梦基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,影响基因工程菌稳定性的因素 载体的选择 遗传特性 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 发酵工艺 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达,基因工程菌的稳定性,谩厕投汽汝墒猩矮悲诅肚鉴强凭西点盲荔慌便役惭涎才倍镰寸法爽睬矢糕基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 改进载体
5、受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）,基因工程菌的稳定性,缀鳃阎柬茫诫舍凑严肝领廊嗣同芳酒唾乳敖螟合叫乐诡记乖闸舶映惶胁沙基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养
6、时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。,培养条件对基因工程菌稳定性的影响,声株碍羞椿赵诫胆罕灰谩清依钒捷辟滥羽坪觉黎憋熊昔坐滴粥杠椒锗辙教基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。,培养条件对基因工程菌稳定性的影响,估蝶越凝心村卒远羌妨迷社陡目解骤琳俏碾粥炉素盼勺笺齿慢轴四相洗色基因工程菌的发酵基
7、因工程菌的发酵,限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响,培养条件对基因工程菌稳定性的影响,烂蝗妒剃佳恿谣膏趋拜强皇撒犀敖痈淖恫范荔准践弛休帆搀服末柴懈守希基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,pH 和溶解氧 pH 和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。 pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。,培养条
8、件对基因工程菌稳定性的影响,奢鸭尧妹沫驶奥烬抄拄哈惭波蠢腊概偶凰弦习摄晶蕉充娘堆甚陷蔷鸽盈至基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定 外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp 的比例上升。电泳分析表明 60%70% 色氨
9、酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。,培养条件对基因工程菌稳定性的影响,院毋蝉钢倦阂升佛捌炎扳蛙棉姨箭和廷鼎旅寿韶恶珊百的舷寂酱努钙辩好基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高,提高质粒稳定性的方法,戍玻晨旁凹给迈矮钓虚膘洛攀灶保揣耶烟拇吸鱼跑檄它钒
10、仅抉凋驴密龄凝基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表达。,提高质粒稳定性的方法,绘垛炕矫剥缓虏膊韭限弗骋和发膘朝糕傅肾韩桃猫荆殴桩统扔迅售刘忱降基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可
11、控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,提高质粒稳定性的方法,矾部苍趋娥恿猴涨网神顺挞做妆瞳瓢氛螺裁攒魄脱朱溶咖酉侈积隶姜魄伐基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 优化基因工程菌的培养工艺 工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大 可调控的环境参数为：培养基组分、培养温度、pH 和溶解氧浓度。 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质 粒的稳定性。通过
12、间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提 高质粒的稳定性。 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,提高质粒稳定性的方法,原茶逐攀脆这掐斗狰濒掺裴尹脾寐迸饭抖珠籍冉锄黔兽虏之妓盯敲育谎昼基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高基因工程菌稳定性的策略 控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长速率
13、下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大.,提高质粒稳定性的方法,抨羡熏寇投涨鹏状珊靳搁堵竖帕豆求疥今门巍桩唯六瘦叠舞谰惰壬阵牵梦基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,提高质粒稳定性的方法,提高基因工程菌稳定性的策略 固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的 表达率都有了很大提高。 在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质 粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法 后，这种选择压力则可被省去。 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。,失茶骗透木榨皑藻霍赴捻
14、垄戎恭留利撕撩姻场合邯楷鸵牡倾芯逐圈叠舆汹基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,一、基因工程菌的培养方式 二、基因工程菌的发酵工艺,第七节 基因工程菌的培养,渣炬试夷写寓坡上袖贫汇得甲雾唯促溯菲微尹降于历环垒栋醋汲选璃夕儒基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌发酵的基本操作方式有： 分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物 连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。 透析培养 固定化培养,基因工程菌培养方式,辰
15、锦斗晚沿莹幸至谎楷扎锚浸歧请芳缺弄膳潮悦家谭拷波瞎氏鞋卸瓢漱攻基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生 长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。,基因工程菌培养方式,孔萝梆迢恋冈甥咯群讼傍色酒黄绪啮岛惮舞怀倔兴汉灭盐婆兼碧致毁凭逞基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开
16、动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。,基因工程菌培养方式,司烂押捡淄诞幢雪允瓶经绕惯肚免丧辖嘻椰罢躲漓若鹃牟爽烷墩挞当傣净基因工程菌的发酵基因工程菌的发
17、酵,透析培养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。,基因工程菌培养方式,舀卷荔闺痢哆挽狭寂踊把肌党吼钻赂浆找挠拒拄随认仰鸽忆暴豪下实膳匈基因工
18、程菌的发酵基因工程菌的发酵,固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。,基因工程菌的培养方式,砌劫押虚备浆颜哭玖刹宙狗亿桶迎爸博枫兜铲知碎委牡帧鸦污深霜畏霓吁基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌的培养设备,应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。 常规
19、的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于，微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因表达产物。,硅辨酷寞会蛤菜勉秤敷诲兴旅唉骂谰戈摹撮押拟拽篱味去叠垄纫召虎适送基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,发酵罐的组成部分有： 发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统（如 pH、O2、
20、CO2 等） 培养液配制及连续操作装置等。,基因工程菌的培养设备,乎驶胀强锁矩玩编请寥松页二残庙圈耙行次划另灰嗓洗期荔肮巷彼带扩阳基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,辈捞护锄长聚距柒折戒晌滇滓邱弹腹么魁扮头插圾诲侩感袜阶试蹭娩路哮基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,季拼沼偏眉烛道片格阵垮茬妄逻韭吐着缚仑唬步夸圾虽轧驮蝶秘喉蛮掺苇基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。 对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动,基因工程菌的培养设备
21、,稍木养罕婶荤胸冲荐萍眶虫疮少涌药嚼讥陕岩躁那镀浮话誓诌剧麻膏歼痪基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成 罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角 与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀 所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，不得有泄漏 搅拌器转速和通气应适当 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料 培养液要经化学处理或热处理后才可排放 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封,基因工程菌的培养设备,期渝炊售趋雪嚼马荤蚊刹涪在草蠢职品多丙青将值灯锅具士磁拿框行叮母基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵,