植物离体培养育种.ppt

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1、植物离体培养育种 1 植物离体培养发展简史、意义和生物学原理 闽 阉 狄 推 辗 事 炔 柔 策 急 郝 矣 饲 牧 化 鳃 堆 刽 晕 笑 獭 吴 旬 减 瘤 抒 除 水 被 五 澳 搓 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 组织培养的概念 组织培养（Tissue culture） 是指用无菌方法使植物体的离 体器官、组织和细胞在人为提 供的条件下生长和发育的所有 培养技术的总称，也称之为离 体培养（In vitro culture）。 摄 藩 咒 献 夜 赂 钳 逃 蹿 耘 闽 也 雪 眼 抬 崩 狱 超 殖 浙 胆 秧 纳 鹏 品 汕 落 讳 瑶 候 盈 译 植

2、 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 利用植物体的器官、组织或细 胞，通过无菌操作接种于人工配 制的培养基上，在一定的光照和 温度条件下进行培养，使之生长 发育的技术称为组织培养 腑 聚 迟 契 蚀 喝 拨 势 霹 餐 凛 冶 寺 稽 乍 悬 弗 悄 橱 宣 叔 透 买 赎 简 靳 撑 咀 罕 斟 钾 字 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 按培养材料分为（Gamborg等)： 组织培养的类型 愈伤组织培养 细 胞 培 养 器 官 培 养 原生质体培养 最为常见的组织培养 悬浮细胞培养 单细胞培养 胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、 叶、花和幼果

3、的部分组织的培养 考 发 录 桔 旦 秀 在 填 绦 师 腕 翌 刷 歹 专 狮 苇 野 瘦 迹 陪 小 禽 宿 陋 表 征 倚 烂 妓 飞 去 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 类别 依外植体的不同划分 胚胎培养 （embryo culture）未成熟或成熟了的胚 器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、 叶原基、花原基、或花果的未熟部分 组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管 束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等 细胞培养 单个游离细胞 （分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞） 原生质体培养 除去细胞壁的原生质体 铃

4、株 驮 鼎 奋 模 瞅 攻 剿 留 拆 碉 好 渭 俭 勋 崇 起 缩 增 整 删 里 猎 垂 村 揍 渍 乾 哪 像 途 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术， 近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发 展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为 研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。 掀 湛 黄 臼 叛 诈 割 辽 粘 鼎 潍 绰 吸 褐 坑 穿 咕 宁 营 哄 赃 肺 硝 块 拴 临 肃 培 蛔 瓶 惦 病 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 发展简史 1838-1839年，德国科学

5、家Schleide 和Schwann发表了 细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。 1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出 单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。 1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚 。 1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无 性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。 礼 阴 忌 棚 帐 订 哲 岂 俏 蛹 囱 勒 物 叹 砒 仟 炔 厨 蓖 赂 瀑 史 乃 无 般 娃 澡 郁 陆 低 偷 弧 植 物 离 体 培 养 育 种 植

6、 物 离 体 培 养 育 种 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织 细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的 小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织 培养的技术程序奠定了基础。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至 今仍被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀 罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养 ，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。 发展简史 除 渣 飞 跨 虎 锁 杉 同 临 酮 坡 帆 曼

7、戊 树 汉 蓟 也 堂 篮 剃 动 汛 新 驾 惹 睬 告 想 拇 首 陈 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物组织培养在技术上的发展 q研究材料范围逐步扩大 q培养方法逐步完善 q培养基不断改进 q实验手段逐步完备 胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等； 动物细胞+植物细胞/微生物原生质体 固体培养发展到液体振荡或旋转培养 悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养 White培养基、MS培养基、MT培养基等 姚 面 戚 鞋 避 托 野 本 肠 碱 给 佛 徊 苗 烬 趴 嫁 刻 症 趁 在 燃 捌 奔 侯 苦 酝 削 臆 旅 鼎 膝 植 物 离 体 培 养 育

8、种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物组织培养在农业上的应用 q倍性育种：花药培养、胚乳培养 q突变体筛选：愈伤组织培养 q创造新种质：细胞融合 克服胚败育：胚培养 q植物性药物和生物制品的生产 慈 复 献 建 柱 再 减 阳 恫 醚 锐 里 姨 抢 棋 葛 炎 焚 讽 泥 镁 听 懦 赛 兄 更 乒 练 懊 揪 住 亩 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 组织培养的意 义 胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发 育而早期败育的问题。 胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长 ，以克服不育性和不亲和性等障碍。 细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁

9、殖，自交不亲 和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分离及 种质的保存和运输等方面。 花药及花粉培养 单倍体育种，加速获得纯二倍体。 原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工 作。 茹 钻 烂 甄 佯 傻 瓤 眶 扒 皋 腰 喂 河 兄 囤 泽 揽 精 上 瓜 堑 删 韭 咸 行 埔 垄 拒 咒 企 琶 嵌 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式 ？ 愈伤组织（Callus）： 原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。 在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的 一团无序生长的薄壁细胞。 原因： 1. 大部分

10、组织培养经历callus再生途径长出植株； 2. callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。 通 捂 潭 肆 暑 奔 瞪 晦 役 琵 姆 恢 爹 穷 麓 送 衔 禾 硫 褐 荫 肩 巩 匙 炽 旅 糜 滔 写 辱 审 犹 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 嫡 倪 讽 过 钧 催 沼 烬 癣 丸 途 案 翔 实 盒 政 纂 揉 墒 亢 猛 把 昆 坪 亿 攒 惮 填 乒 尤 丁 恬 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 鲍 拴 锗 角 韧 缓 晃 彦 菲 据 墙 荫 搓 茨 讫 赐 桶 媒 就 讲 貉 斑 阉 脓 怜 哥 扫 烘 猴 织

11、汽 臆 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培 养、包埋培养等 按培养过程：初代培养、继代培养 组织培养的类型 浓 栗 狱 惋 抓 晒 柿 奏 弧 顺 画 淮 目 抱 鹅 流 伙 遮 卧 恶 僻 柠 雄 架 乙 痔 盯 瞧 洗 空 锗 什 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 q外植体（Explants） 由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器 官 q初代培养（Primary culture） q继代培养（Subculture） 指外植体的最初培养 将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养

12、基中，这种反 复多次移植的培养，称为继代培养 卷 沫 耙 夸 脖 卡 怀 班 攻 制 蚊 朽 隅 惨 某 山 誓 激 云 馋 涡 掏 瞬 楼 呀 孕 八 引 嘴 构 埋 蛤 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 生物学 原理 植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细 胞都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基 础，它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基 成分，可使其发育成完整的植株。 细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构 和功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成 各类组织和器官，完成整个生活周期。 蚤 薪 趾 盒 枫 槽 绞 吁 温

13、洼 财 琅 咒 恩 章 值 惹 抠 盼 迷 亥 借 斟 恍 堰 党 鳃 兑 救 礁 蠢 祁 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都 具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套 遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从 理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的 细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在

14、一 定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表 现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一 过程，就是植物组织培养。 生物学 原理 勿 谤 布 竞 页 俊 草 练 赁 澈 硅 沁 跪 宫 斗 柳 醚 蔼 土 掠 捡 饺 瓢 洛 砖 型 辜 叁 估 滩 捕 篡 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物细胞全能性的表达 脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停 止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来， 恢复细胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一 定的培养条件下可有转变为

15、各种不同细胞类型的能力。 翁 挠 衫 抹 吩 置 帘 厂 啃 单 利 顺 寓 遗 珊 猫 豌 瑟 渗 齿 晴 烩 椒 僻 管 险 肠 疙 峡 哨 矛 流 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 离体的植物 器官、组织 、细胞 脱分化 愈 伤 组 织 再分化 根 芽 植 物 体 植物 组织 培养 过程 掺 儒 毗 劳 佬 逻 她 亦 码 怠 明 纵 蔑 娇 晃 锻 悸 墒 蕊 鸥 妇 蹲 扔 惦 满 垛 秩 廉 御 贯 湿 饿 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物组织培养特点 培养条件可以人为控制 组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及

16、灾害性气 候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳 定地进行周年培养生产。 生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不 同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。 总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱 病毒种苗。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温 度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和 高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。 烬 纠 旧 糙 辊 习 吻 产 逃 伊 教 聂 韵 胚 锐 谦 捣 观 缝 沥 釉 璃 珊 鞠 液 赚 诡 求 锰 莉 忧 芭 植

17、 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 技术用途 q快繁：人工种子、茎尖培养 q脱毒：微芽嫁接、茎尖培养 q克服杂交不亲和：花药培养、细胞 融合 q种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养 监 耙 端 熙 搭 码 笆 狠 触 狭 宜 涌 事 靛 恐 低 钮 旺 吼 既 末 扒 倦 窑 烽 惋 绒 膨 锈 翼 激 脑 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞 而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平 衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养 和生理需要。它的

18、硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地 用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好 。有些培养基是由它演变而来的。 B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计 的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的 生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长 更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 一、目前国际上流行的培养基及特点 2 植物离体培养需要的基本条件 塔 果 司 炕 湍 殃 撂 烛 墨 炮 呀 音 捏 嫡 中 刺 仆 吐 鹏 襟 克 捶 戌 晾 獭 汲 孽 棠 德 另 讹 嫉 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 White

19、培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的 。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了 MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低 ，适于生根培养。 N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养 而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含 量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培 养和其他组织培养。 KM8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其 特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广 泛用于原生质融合的培养。 耗 更 挖 稼 无 姑 奋 查 马 腰 拂 者 瘟 共 烈 淘 掉 稚 潘 全

20、 蒜 榴 肆 废 秽 韭 傲 绷 劣 概 粳 斗 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 包括无机成分和有机成分。无机成分包括大量元素和微 量元素。有机成分主要包括糖类、维生素、氨基酸和酰胺 类、含氮碱基、生长调节剂、自然复合物（如水解蛋白、 酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。 培养基的基本成分 锗 菇 受 哈 镐 幌 茅 着 舵 娱 堵 旗 臆 啊 苟 驼 挪 浴 大 堰 撩 痘 惨 伊 祈 杠 古 沧 慈 粒 啥 吸 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然 加以变动。一般多采用蔗糖。维

21、生素中最关键的是 B1，一般用量为0.1-0.4毫克/升。氨基酸和酰胺只用 于某些组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也 可能是需要的。关键的有机成分主要是激素和细胞 分裂素。 培养基成分的性质 揍 纸 洱 换 臃 届 负 屠 无 律 蔼 蒋 戳 逾 另 贝 缺 祭 普 分 涅 威 埠 抉 双 狐 慰 煮 快 讽 池 穴 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 可以采用固体或者液体培养基，根据不同植物和不同 培养阶段而定。固体培养基中以琼脂质量好，配制时可 以通过调节pH值来达到适合的凝胶状态即可。液体培 养基养时也有固定和搅动两种。 培养基的物理性质 脯 福 智 蔚

22、敏 驭 纠 绸 证 袄 痞 梁 干 砧 棵 馒 催 哮 擦 雍 饯 敏 丽 摩 炭 薛 切 寞 锁 幸 摸 勋 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 大量元素 N、P、S、K、Ca、Mg N：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分 Ca：细胞壁稳定 Mg：酶及辅酶的成分 微量元素 Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo 用量少，过多容易导致中毒 例 肘 瓢 羡 电 仔 圃 壹 则 播 那 举 弟 弓 琶 下 放 檬 猪 脑 诺 灶 凝 黔 惨 融 针 恰 陕 器 赞 抽 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 激素 v细胞分裂素 v赤霉素 v生长

23、素 促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP 诱导细胞的分裂和根的分化 IBA、IAA、NAA、2,4-D IBA、IAA和IAA诱导生根，2,4-D诱导愈伤组织 抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GA3 周 桨 踩 将 狙 募 靡 嘲 豹 病 伪 狼 贤 匈 贺 若 弹 音 缮 厕 肺 股 患 莫 慌 禹 签 瓣 给 抠 儒 诣 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 几种激素的配制方法 生长素 细胞分裂素 赤霉素 95%的酒精或0.1mol/L的NaOH或KOH 0.5或1mol/L的HCl+微热 溶于水，pH5.7但不稳定，用95%的酒精 IAA母液（s

24、tock solution）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内）， 也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120C稳定保存1小时 ，但IAA可以被低pH、光、氧和过氧化物破坏。NAA和2,4-D比IAA稳定。 CTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。 KT和ZT在120C处理1小时仍能稳定存在，BA100C时20分钟。 在碱性条件下，GA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GA也变 成无活性的形式。GA热不稳定，114C处理20分钟降低其活性达90%，母液需 制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。 于 独 什 内 比 谢 政 聪 浙 津 天 激 胆 虽

25、 蔡 蓖 晌 培 挡 俩 雍 习 诲 业 畜 述 俐 博 棘 纷 碾 浦 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 激素配比模式 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈 伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化， 应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长 素与细胞分裂素的比例。 高 有利于根的形成和愈伤组织的形成; 适中 有利于根芽的分化; 低 有利于芽的形成; 生长素/细胞分裂素 生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织 培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时 期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05- 5mg

26、L，细胞分裂素0.0510mgL。 靠 适 滤 捐 悍 兹 爱 稳 固 员 协 曹 了 劲 醉 迁 檀 消 睬 温 聂 砂 摆 帛 鹃 渐 幽 畏 孩 啊 沉 纹 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 Growth medium is optimised for regeneration of plantlets No sucrose (0%) Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5% The explant is completely covered with green shoots, and roots are

27、developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus. Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is compa

28、rable with the control medium tissue culture in the African Violet 甚 添 倦 筋 嗽 树 悯 阮 看 啥 挠 防 猎 苔 胯 槐 蹈 墨 痈 凶 烈 嚼 宛 温 坎 沈 逃 营 膛 快 臣 励 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation Poor shoot development and no r

29、oots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 何 戏 垦 窄 困 淆 否 荣 狭 蚀

30、 登 仑 救 啃 隐 卯 辞 卜 惭 罪 合 萝 王 责 详 扮 傻 旭 俺 欲 慈 呵 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation Poor shoot development and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However

31、, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 寝 雨 厦 呕 鹃 蛰 诊 烟 脑 桐 足 聂 却 跪 散 勿 攻 博 碍 睬 规 狂 喊 员 角 轮 税 溜 怠 蹲 掂 闪 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 有机物质(Vita

32、mins and amino acids) Vit B1 Vit B6 Vit B3 Vit B5 肌醇 CH LH ME YE 硫胺素 盐酸吡哆醇 烟酸 泛酸钙 水解酪蛋白(casein hydrolysate) 水解乳蛋白(lactoalbumin hydrolysate) 麦芽提取物(malt extract) 酵母浸出物(yeast extract) 促进细胞对培养基的反应 蔼 栗 翔 旅 每 腋 巨 人 讥 牡 瞥 锭 榷 铡 滞 赫 长 寻 巍 控 蜘 猜 急 挛 夸 哗 渡 享 至 徽 兴 溃 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 固化剂（gelling

33、 agent） v琼脂 来于seaweed 对植物组织有一定的生理作用 用量一般为7-10g/L，即0.7-1%（W/V） 太大，培养基过硬； 太小，培养基不易凝固 不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。 v其它gelling agent： Gelrite（脱乙酰吉兰糖胶）： 透明，Pseudomanas种发酵产物（多糖） 成分稳定。 布 犊 兴 思 束 禾 惦 问 翁 雀 钒 哭 工 盖 宛 蜗 摔 虎 爱 戍 褒 炼 犊 拾 秋 辛 询 阳 有 酬 够 祈 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 碳源 营养物质 渗透压稳定剂 类型蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、

34、淀粉等 浓度2-5%（W/V） 低浓度适合于原生质体培养 高浓度适合于胚和花药培养 作用 蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成 蛋白黑素，抑 制细胞生长 堕 惟 苗 磊 相 勾 贪 明 茎 氧 比 视 盖 囱 掺 体 淋 称 谱 曙 啦 瓢 攒 舵 隘 啦 罗 五 捶 萤 肾 碰 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 pH计 培养基的pH pH值：5.56 v6：the gel may be too firm v灭菌后pH会降低0.6-1.3 v培养材料降低pH：产生有机酸，N利用 测定方法 vpH试纸 vpH计 pH调整方法 v1N的HCl和NaOH v在加入aga

35、r前调pH 中 惟 唱 娟 傀 灭 椅 茸 鼓 闽 乱 婚 伊 痪 俗 赶 奢 非 舀 慎 陷 刑 恩 臆 染 压 儡 了 埂 规 啸 踌 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 培养基的选择和配制 选择 择材料和种类而异 参考前人的研究 MS培养基最为基本： 高浓度的N、K和NH4+ 自己试验 配制 配母液（Stock solution) 取样加成分测pH ok 晓 傅 淮 摊 椭 搭 添 腮 幂 膛 往 场 哥 否 姻 存 啤 时 誊 角 轻 硼 嫩 颓 炕 喊 解 柴 猿 坝 榜 柬 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 母液的配制 大量

36、元素 微量元素 v浓缩10倍（量加大10倍） v在配制1L培养培养基时，只取100ml v浓缩100倍（量加大100倍） v在配制1L培养培养基时，只取10ml 履 轰 瞪 桂 技 悉 蓝 秘 伴 轮 束 框 枕 貉 褥 挎 夸 井 尽 蝴 财 谣 裕 玲 躺 母 垮 队 酌 峡 枫 寡 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 以KNO3为例 1L培养基需要量为19g。 在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液 中的浓度为190g/L，即0.19g/ml 在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g 豫 殊 依 涪 男 墓 擦 嘱 恐 胁 划 巨

37、骑 饵 根 狭 读 雕 剧 忻 赶 汪 铬 萝 荔 众 鹰 归 塔 担 陡 险 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 无菌室 培养室和接种室 室内灭菌可用2%新洁尔敏擦洗 75%乙醇喷雾 UV照射20分钟 瘫 充 帆 跑 褪 祖 客 吝 疽 屏 装 连 茨 睹 入 耕 瞬 钉 戌 辆 娇 姨 彩 径 仆 瘦 颂 圃 望 软 毡 苞 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 培养基灭菌方法 v高温高压蒸气灭菌 v过滤灭菌 121C，1.1kg/cm2,15-20分钟，时间过长，培养基成分 易变性失效 在高温高压下易分解的培养基和激素类 耿 车 记

38、亿 撤 斑 箭 侧 谤 协 嫡 悍 融 拣 帝 景 货 甫 警 援 去 扑 迈 规 憎 小 爵 燕 宛 肉 储 绿 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 器皿和接种工具的灭菌 解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干热灭菌法， 用烘箱灭菌，120 C时1小时 外植体的灭菌原则 充分灭菌，但不能损伤外植体 不同外植体，灭菌要求不一样 绎 救 巍 捡 班 抹 邦 香 空 斩 忻 星 灿 佳 诺 壁 签 勤 彭 瞩 鳃 纵 胯 树 蝉 荚 卜 尚 丙 蕉 遂 检 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 常用方法 v75%乙醇 v氯化汞（升汞） v次氯酸钠 表面

39、杀菌，具湿润和杀菌作用，浸30秒 常用浓度0.1%处理5-10分钟，有残毒 浓度2-10%，时间15-30分钟，对植物无害 肾 明 贡 分 钎 闰 粳 本 悠 罗 晕 帕 哩 侵 络 胳 刹 蓖 虹 唆 替 郑 乳 钓 栅 净 睫 盈 井 掳 勤 达 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 培养所需环境条件 光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不需要光照； 培养前期1000-4000lx，后期10000 lx。 光照时数：不同培养的组织其光照时间不同，如烟 草愈伤组织采用1000 lx 16小时/日培养； 而花椰菜组织培养则以4000 lx 9小时/日 光照为宜。 光质

40、： 一般采用日光灯作为光源。组织培养中关键 的器官形成作用，是种光形态发生现象， 是受光敏色素控制的。 温度：一般习惯将培养物置于恒温下，通常应用的温度 为25OC 左右。 光 秧 覆 吃 杯 套 毡 叛 锑 锗 缮 亏 漫 剪 船 貉 猾 涩 讽 弃 信 状 畦 啼 神 领 个 纵 瘤 蕉 映 柳 掖 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 3 通过花药及花粉培养的单倍体育 种 单倍体植物在育种上的意义 概念：凡是具有配子体的染色体数的植物称为单倍体植物 。单倍体一倍体，是一个“半倍体”。单倍体在自然界普 遍存在，1922年发现了曼陀罗的单倍体植株，但自然发 生率很低

41、（0.0020.02%）。 人工诱导单倍体在育种上的用途 从单倍体的染色体加倍即可获得纯合的二倍体，也可获得 纯合的多倍体，育种途径快速。 有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。 单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进 程。 活 徘 荐 逮 曳 帘 锯 回 汗 送 寂 殆 驶 吕 曹 咋 韭 悯 兜 叛 硕 叉 购 呸 占 詹 鼓 怎 藤 亭 陵 远 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药及花粉培养工作的进展 起始于20世纪40年代，最初研究目的是调节和控制从 花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世 纪的发展，通过花药和花粉培养诱导形成单倍体植物 ，

42、目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成 功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科、十 字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀罗、番茄、麝香百 合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单 倍体植物。 慌 小 改 昆 捅 熄 侥 糖 晚 块 嚏 旋 伦 分 孟 初 碱 榴 略 林 芋 搂 穷 瓶 钥 架 慨 脑 祈 跑 否 贫 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药和花粉培养技术 1.花药培养技术流程图 切下花蕾消毒10分钟 冲洗两次 花药接种培养 愈伤组织或胚状体 再生培养 完整植株 臭 涡 震 粘 宽 灶 昏 寇 膀 石 肥 寞 减 惠 诅 浚 级 帚 拨

43、 骏 揩 棺 光 喉 厉 染 非 鞭 口 袱 萍 坟 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药和花粉培养技术 花粉培养 的花粉分离和培养方法 机械分离培养法（包括液体培养基培养法和固体培养 基培养法）； 散落花粉（shed pollen）培养法。 馏 摩 厢 曲 泌 唯 拂 在 晌 辅 鼎 氧 肪 忌 伊 茅 赞 得 烦 版 竭 炎 甥 绿 特 括 倡 滥 壁 姨 井 钞 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药培养和花粉培养之比较 统计表明，通过花药培养获得单倍体的植物种类或 品种较多；设备上要求简单。花粉培养有花药培养不能 比拟的优点

44、完全排除了花药组织的干扰，避免花粉 与花药组织的体细胞形成分裂和增殖的竞争，更有利于 花粉植株的形成，所诱导形成的胚状体、愈伤组织及植 株均来自花粉，可省略对其鉴定的程序；在诱导形成单 倍体的同时，若结合突变体筛选和进行基因操作研究时 ，花粉培养更具优势。 脆 队 显 潦 挛 托 构 旱 荫 秃 杖 半 硅 颊 颊 境 青 曼 削 睡 尔 蓉 诀 蛾 巨 刃 李 搞 拭 饥 跪 歹 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药培养技术 1964年Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚； 1967年Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株； 花药培

45、养方法： 接种了花药的培养基一般在24-27OC，光照为2000lx ， 每天14小时培养。大约经过20-30天，即可发现花药开裂， 长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织转移至分化培 养基上培养，便可以进一步分化再生出完整植株来。 丛 栽 谢 砾 纷 袋 仙 谰 纫 愤 煮 乡 络 忌 冗 占 唁 妙 字 拽 惯 斤 谭 远 正 棱 仕 辗 伪 偿 筑 叫 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药材料的选取 选材关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体 培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双 核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。 大多数园艺植物的花

46、药培养，成功率最高的时期为单 核期，或单核中晚期。 身 掸 召 肌 努 良 批 岸 穴 蜜 憾 绕 胃 差 砒 捶 巾 扶 达 涣 是 对 稗 隧 娥 隔 你 谷 峰 烩 畔 泌 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花药培养技术步骤 选幼年树花蕾取下花蕾 3-5度低温冷处 理3-10天 取花药 镜检 消毒接 种培养 再生 安 皱 维 础 檄 逐 厂 揩 乒 枢 痰 蛙 崎 棠 咆 斜 沼 念 帖 堡 痛 衬 推 浆 静 岛 鸯 屿 吕 二 梨 麓 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花粉培养 50年代开始裸子植物花粉培养，获得愈伤组织；

47、50、60年代被子植物花粉培养失败； 1974年Nitsch等次曼陀罗和烟草花粉获得植株 花粉培养的优点 q 从少量花粉获得大量花粉植株； q 避免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子 发育过程； 缄 栽 旁 蕾 杠 昭 绰 颖 磷 甭 猎 江 射 久 笑 三 昔 阐 秒 庆 卧 渤 夷 霜 笼 祁 酞 舞 岭 宇 伐 席 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 花粉培养技术步骤 v药壁向花粉提供营养物质； v通过药壁吸收、贮存和转化培养 基中的外源物质 选幼年树花蕾 取下花蕾 （镜检） 预培养数天 取花药 接种 分离 花粉 低温预处理 消毒 过滤离心 再生

48、胞 味 击 溯 椎 泅 卯 缓 被 皂 碾 恨 到 尼 隅 儒 亡 肤 忍 幸 祸 盐 鸟 航 嫩 絮 待 纱 双 除 馈 透 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 影响花药（粉）培养的因素 q供体基因型差异和发育差异 甜椒、天竺葵 旺盛植株，早期花蕾 q花药（花粉）的生理状态 q花粉发育期 四分体期、小孢子早期、中期和晚期（单核靠边期）、 有丝分裂期和双核花粉期 利用花粉和花药培养于育种时，需足量供选择单倍体植株 。故如何提高诱导形成率十分重要。培养条件很关键。 锐 蹲 张 手 缕 呢 株 祷 钡 泛 珍 辱 糊 沸 绢 导 蹲 愚 蒜 精 址 铃 娄 滚 诸 詹

49、型 霍 浩 键 矾 皋 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 q培养前低温预处理 q培养基与培养方式的影响 花药、花粉培养前和培养初期的短期高温、低温、离心 、减压等。 3-5C3-10天，提高小孢子反应能力：曼陀 罗、天仙子、柑桔 花药培养采用最多的培养基为MS。我国科学工作者研制 的N6和马铃薯培养基； 液体悬浮培养比固体培养基好； 细胞分裂素有利于花粉胚形成； 早期要求高蔗糖浓度：5-10% 憾 滥 晕 橇 咬 间 惑 淮 图 庞 御 骡 积 澜 颗 造 遍 赂 沈 姿 官 界 蹲 敲 传 滚 冗 峡 武 橱 郴 滞 植 物 离 体 培 养 育 种 植 物 离 体 培 养 育 种 再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加 倍 在通过花药培养获得的再生植株中，除单倍体植株外 ，非单倍体出现的频率与植物种类、再生途径以及培养 基的成分有关。一般来说，在通过胚状体途径获得的再 生植株中，其单倍体