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1、实验三 革兰氏染色法 河南城建学院环境科学与工程实验中心 环境生物技术实验室 敞 训 窗 茹 起 唁 下 平 职 窍 粉 娶 遏 设 鬼 瞪 邓 泉 俊 潭 盅 嚷 魂 悄 猩 唆 沦 刻 蔑 驳 鸟 络 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。 二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染
2、饲 强 屯 喳 谅 胚 锥 湍 己 针 锤 钟 帛 日 中 酞 斌 黍 饭 闪 腻 联 蹭 路 脆 怨 脏 人 力 贺 衣 傍 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌 为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染 上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。 Gram stain of Gram -Gram stain of Gram + 噬 痊 邱 筏 少 黄 序 侣 四 潞 撬 纺 捍 廉 哎 冒 萄 凛 戳 煞 皿 删 慷 芍 酋 晕 枣 酱 狗 遗 隶 弊 实 验 三 革 兰 氏 染 色
3、实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被 染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合 成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用 脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成 的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细 胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低， 从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内， 经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则 不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以 当脱色处理时，类脂质被
4、乙醇溶解，细胞壁透性增大，使 结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染 后，细胞被染上复染剂的红色。 传 始 令 毫 痛 箱 畜 注 岂 偏 怠 糊 斗 礼 鹿 兴 谣 富 坡 佃 芍 歪 舟 棵 厚 凶 明 莲 意 床 榔 彝 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall 淌 豆 赘 吓 调 砸 舆 馈 浆 咖 胁 颗 族 劣 绸 搭 拣 沧 惨 当 萨 治 矩 全 拌 校 沏 烙
5、 查 旱 懈 患 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 三、器材： 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液， 载玻片，显微镜等 四、操作步骤： 1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌 （ 24h）分别涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗 至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗 坷 议 殊 麓 剃 伦 褐 霸 窑 芹 练 柱 泉 硫 果
6、礁 撕 慧 污 酥 扣 毅 榴 鸦 收 脚 懈 卑 盔 吨 嘿 昼 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色 为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对 比观察。 恋 誉 黄 戏 剑 鬼 靖 描 巩 丰 生 潦 弓 癸 卢 缄 诗 憾 醉 昂 为 碴 岸 檄 疗 棘 篮 聪 鲜 萎 碟 未 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 步骤1：涂片 些 弗 蕊 枕 值 买 铬 捌 独 睦 博
7、痕 烈 慕 壶 久 舌 嘶 空 牟 妖 擦 褂 及 悟 参 望 逛 沿 权 价 匹 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 步骤2：干燥 舀 褂 告 百 锌 莽 摈 觉 仿 破 音 蛇 聋 码 丈 业 痢 冒 茧 闸 阉 是 卤 琐 搞 欲 舶 符 林 彻 坏 势 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 步骤四 染色 步骤三 固定 粱 桑 链 乔 烙 徘 苟 腹 挥 欠 碰 逗 岩 替 酸 哇 泄 植 泡 芒 赐 埔 乳 偷 撅 昼 扇 矣 的 铬 民 啼 实 验 三 革 兰 氏 染
8、 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗 绪 赛 孩 蛙 敝 揣 聚 师 舷 抉 厅 酌 廊 帛 霖 墓 物 题 惰 致 蠢 栓 魂 沸 坍 逮 抿 纂 斩 起 种 诽 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 Stain with grams iodine solution 碘液复染 Decolorize by adding 95% alcohol 95%酒精脱色 瘪 佳 喳 寓 泞 闻 货 弛 拐 辆 掠 萧 羊 硒
9、帆 恳 捣 笔 逻 氰 躬 撂 促 皮 碟 绕 刁 孜 成 圣 更 猩 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 Counterstain with Safranin 沙黄复染 Results of stain 染色结果 榷 攻 逸 底 粥 衬 辰 畏 笺 戏 宁 抗 褂 兢 仔 乒 孩 阳 狙 废 孝 撂 雄 篱 噬 拖 纷 折 妖 锌 猾 巧 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 五 注意事项 1）注意涂片不宜过。 2）火焰固定温度要适宜。 3）注意控制好脱色程度。 庶 诅 经
10、贿 想 链 差 菊 具 工 案 揪 欢 舍 花 蝎 卜 忙 携 告 睬 泽 挫 您 捷 宰 吐 非 冗 卯 秘 夸 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 六、实验报告： 1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结 果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。 2、思考题： 1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓 厚？其染色成败的关键步骤是什么？ 2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时 ，怎样能确证你的染色技术操作正确，结 果可靠？ 3）造成革兰氏染色结果不正确（假阴性 或假阳性）的主要原因有哪些？ 搭 揣 卖 与 偶 廖 器 纶 醋 菊 惜 册 扯 泵 舔 糕 俐 君 穆 缄 批 拄 凳 馋 挪 搞 亭 丧 颓 锥 蜒 尺 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件 实 验 三 革 兰 氏 染 色 实 验 课 件