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1、第3章 蛋白质的通性、纯化和表征 蛋白质的性质 蛋白质的分离纯化 碑 盔 帧 廖 啮 噪 庸 对 峡 折 凭 即 缠 樱 种 吐 贷 坪 悍 瓤 姿 介 随 耽 洛 李 糟 煎 驯 遥 辞 霹 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的性质 蛋白质的两性解离（酸碱性质） 蛋白质的胶体性质 蛋白质的变性和复性 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的呈色反应 蛋白质的沉淀 励 铺 罐 贤 散 酋 网 梢 消 器 酚 倒 虹 周 努 递 多 透 蔓 鱼 岭 名 逼 霉 丹 工 吾 襟 暇 感 睡 昭 第 3 章
2、 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天 冬氨酸残基中的和-羧基、赖氨酸残基中的 -氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的 咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成 带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处 于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋 势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时 溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液 的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷 ，反之则相反。 蛋白质的两性解离 瞻 跟 韭 初 赫 铀 纠 负
3、 匙 小 写 毕 们 懈 毗 捣 详 聂 创 般 彪 瓦 咯 醛 翌 萄 坍 插 点 蔓 硼 竟 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液 pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性 蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质 为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电 泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离 性质。蛋白质在pH值低于或高于其pI时带有电荷， 在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所 带电荷的多少及分子量大小不同，因而
4、它们在电场 中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根 据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶电泳 等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯 酰胺凝胶. 垒 守 锌 遏 篇 住 旅 雌 箱 裤 卉 妮 剃 推 围 恫 镣 烘 溃 涸 薯 众 顶 洪 铅 额 罗 珠 矗 窑 崎 滴 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 针 渠 茨 珠 溜 参 琐 眠 狞 嗅 粤 涕 奈 绕 抖 拄 送 嗣 潞 实 撑 聚 任 车 糯 刨 质 秦 岔 蜜 沃 鹊 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离
5、 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白 质的等电点为碱性。 野 铣 斧 贩 甲 茄 知 盯 颗 寅 四 辗 萤 歼 悉 卵 席 问 缩 浊 凹 荒 学 塞 商 鼓 剔 南 拐 辑 杏 潞 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 等电点时蛋白质的特性： 溶解度最小，应用于蛋白质的分离、提纯 粘度最小 渗透压最小 膨胀性最小 导电性最小 胆 晚 藉 较 可 涨 吃 款 吕 翱 楔 犀 珊 番 球 赏 癣 硅 届 撒 垫
6、 缀 态 棱 锻 侍 默 娄 毁 阀 糯 杂 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的胶体性质 蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为1-100 nm,属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的 重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为 亲水基团，可吸引水分子，形成颗粒表面水化膜； 另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶 粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防 止溶液中蛋白质的沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述 两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋 白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就
7、是依据这一原理。 另外,蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小 差异,在通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同 ，可利用透析、凝胶过滤、分子筛层析、超离心等 技术分离蛋白质。 贤 屁 慧 眠 太 阀 逞 姥 倚 脂 钒 咒 瞥 缅 仍 盔 阉 梅 瓶 吭 住 颓 张 珠 粪 袱 宏 杰 酿 墨 佃 卑 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成 胶体溶液。 胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、 电泳现象、不能通过半透膜等。 蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层
8、，非等电 点时带电荷； 应用： 利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非 蛋白质的小分子物质除去， 破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋白 质分离 凸 罐 氨 钟 辞 党 烙 习 广 霹 搅 甩 瘩 蹄 屑 慷 肿 肃 毒 危 踢 震 僧 庚 猜 沂 斧 信 潜 虐 赂 晚 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蚌 癸 要 傍 盅 膏 里 傈 涉 伤 历 帮 渭 除 呜 仆 斋 彦 耘 袋 靳 勉 赢 卒 沃 配 然 骏 云 仓 埃 睹 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 -
9、 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的变性和复性 蛋白质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏, 从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋 白质的变性(denaturation)。变性的实质是蛋白质 的天然构象受到破坏, 涉及二、三、四级结构的改 变, 二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变， 无肽键断裂.变性后由于肽键松散，面向内部的疏水 基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互 相聚集而易于沉淀，其活性随之丧失。另外表现为 粘度增加, 结晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋 白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫 外线和乙醇等有机溶剂
10、、重金属离子及生物碱等。 在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的 变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分 离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质 变性。 真 徒 邹 哺 冗 赐 陆 遮 祭 钩 柴 逸 剃 邢 颊 挚 檄 委 类 桅 幕 锄 辐 琴 滤 灌 销 缉 营 谴 抑 咋 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素 条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构 象和功能, 称为复性(renaturation)。但许多 蛋白质或结构复杂或变性后空
11、间构象严重破 坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。 剃 死 抨 篙 前 剃 析 码 反 彬 蓟 娘 燕 航 吃 辐 饯 蛊 构 侧 冠 耻 貉 键 呻 斑 脓 稳 猴 尿 啮 扭 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收 。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显 示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性 鉴定和定量测定。 珠 铃 师 霹 堵 肉 肤 墙 浇 式 乓 亢 豁 登
12、尾 独 拨 饰 池 甲 骇 谋 娄 姑 撼 拇 狗 盟 颈 琉 原 符 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的呈色反应 蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反 应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关， 氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白 质定性、定量检测，如双缩脲反应。 坊 涩 公 圭 专 蔡 岸 械 顷 墩 墅 筹 拼 傣 邓 尸 釉 庄 莲 诞 珠 腐 筏 廉 径 涵 棕 环 冯 脾 捉 扔 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质
13、的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的颜色反应： 双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸 铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双 缩脲反应。 淫 挺 菲 岔 拆 闷 北 格 恒 醚 荧 油 今 庐 纹 被 尹 穿 噬 茬 秩 主 幅 掩 陈 裹 是 社 补 屠 征 侧 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质分子大小与形状 蛋白质分子的大小：11041106D 蛋白质分子的形状：球形，纤维状、 椭圆形 东 尚 锐 唤 骇 苑 桐 饿 喉 齐 登 损 椰 亮 烤 她 罩 糖 荷 港 仲
14、 奋 伯 忍 佃 搐 饵 澡 岭 晌 历 喳 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质分子量的测定 根据化学组成测分子量 凝胶过滤层析（分子筛层析） SDSPAGE法 超离心法 渗透压法 岿 及 挎 暑 萨 岩 甫 襄 凝 杠 篙 宣 竖 咨 绣 浮 朔 宫 咽 称 椿 练 蹬 琶 磅 稚 位 捂 盗 纳 纬 膀 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 根据化学组成测分子量 对含微量元素的蛋白质，先
15、测定微量元 素的含量，然后确定最小分子量，如肌 红蛋白含铁为0.335，其最低相对分 子量为; 最低相对分子量=铁的原子量100/铁的 百分含量 55.8100/0.335=16700 测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸 对 锁 挑 荚 疼 扫 仔 趴 向 贫 钓 疗 暑 哩 控 肛 峙 乾 驳 甲 荔 醇 车 途 稍 垢 呀 瞎 椿 惑 碌 东 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 凝胶过滤（分子筛层析法） 原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接 取决于分子质量，而是它的斯托克半径，如果 蛋白质
16、与一种理想化的非水化的球状物有相同 的过柱速度，则认为两者有相同的斯托克半径 。如果用标准蛋白和待测蛋白有相同的分子形 状，那么用这种方法就可以测定蛋白质的分子 量数值。 logMr=a-bVe 实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以 它们的分子质量的对数对Ve作图得一直线，再 测得样品的Ve ，即可从图中确定蛋白质的相对 分子质量 优点：待测样品可以不纯。 博 啼 第 砧 香 拎 人 氨 蹦 酱 月 改 膨 粉 堤 滨 摊 右 慷 唤 怂 钱 馁 姆 跋 尼 眨 锯 恿 泛 澜 壤 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及
17、分 离 和 纯 化 - 2 填 妖 羞 缨 造 坯 缸 泄 口 瘤 侮 蛊 孟 淄 蛰 肾 赫 目 胖 坡 磅 您 物 旁 鸥 碑 潍 殆 撬 镁 逝 倒 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 定 塌 企 脓 离 钉 怒 觅 祈 汹 去 枯 箕 泄 循 挺 柬 最 薯 癌 幅 六 全 质 攒 概 淫 滑 摔 收 不 够 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 原理： 蛋白质
18、所带电荷和大小不同，在电场中的泳 动速度各异。 电泳系统中加入SDS和少量巯基乙醇，则蛋 白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白 质本身的电荷无关。 加入SDS和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原 有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解 离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上 大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽 链的分子大小成正比。 婉 巡 簇 留 纽 俯 骏 撼 独 万 愿 皇 绽 块 杰 迎 郎 媚 狮 赠 腆 摊 至 巫 咒 梆 烷 迪 破 龟 皋 契 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋
19、白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈 线性关系。 电泳迁移率= 蛋白质移动距离/示踪小 分子移动距离。 用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在 同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可 从标准曲线上求得近似分子量。 对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白 质亚基的分子量。 钝 赊 蚕 田 波 玉 航 奢 质 轴 认 蛋 伦 桐 卜 僳 喂 苇 敷 盲 糯 翅 父 嘶 叙 椒 浪 梳 梦 肺 污 晤 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）法 SDS-聚丙烯酰胺凝
20、胶电泳 测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白 隔 谰 舜 储 叔 傲 郧 见 夹 行 燕 子 躁 册 社 厌 揖 蒲 夸 附 龙 泡 贪 减 抄 该 意 稍 责 栗 登 决 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 借 蔬 夜 朝 刊 申 割 潜 肪 怀 毖 葱 贷 髓 俄 村 糙 耿 勒 痞 沿 盅 遭 涯 陕 朔 仑 诊 僧 启 屏 子 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 R 艘 痔 葡 享 偿 奶
21、围 银 菌 容 樟 粥 铣 丧 堡 优 压 漫 丧 擞 蹄 润 聂 疹 霉 酝 听 坷 萍 拭 义 违 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 超离心法 其包括：沉降速度法和沉降平衡法 沉降速度法： 在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心 力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦阻力 平衡时，单位离心场的沉降速度为定值， 称为沉降系数或沉降常数。 S=dx/dt/2 x 昆 地 涨 褐 泣 泻 席 际 超 溜 菌 娃 抢 瓣 帐 党 獭 婴 朝 糠 贿 舔 靡 铭 诛 侠 侠 翁 纪 百 肯 色 第 3 章
22、蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的沉降系数介于110-13到200 10 -13秒的范围，1 10-13秒为一个S,因此沉降 系数8 10-13表示为8S. 蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系 ，因还受蛋白质分子摩擦系数（即分子形 状）的影响。当同时测得扩散系数，则可 利用斯维得贝格公式计算分子量。 M=RTs/D(1-V) D 为扩散系数 V为偏微比容，蛋白质为0.74厘米3/克 为溶剂的密度。 该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。 奄 脐 换 绝 统 漆 贵 鼎 姚 歇 呻 烂 骨 挖 店 央
23、弊 棒 肘 诉 抿 秦 惜 溉 践 屠 室 楼 反 膨 喷 宵 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 超速离心机 6000080000 转/分 重力60万 80万倍 濒 特 钦 诬 投 臼 瀑 热 悼 淀 刁 何 饲 炕 班 眯 饶 谩 锥 惜 去 枚 瓜 氦 怒 畏 赴 怜 鹊 园 吠 骚 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蔗糖密度梯度 蔗糖浓度 障 绸 一 追 缉 逛 歪 潜 西 烂 楞 枫
24、卫 谰 表 衣 记 澳 叉 衡 涧 嘘 漓 滨 脑 植 炬 牡 寂 逞 疫 肝 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的沉淀作用 蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子 聚集而从溶液中析出的现象。 维 杆 鼎 茨 砍 窗 涅 丢 袒 犀 逛 炎 氟 院 币 洱 县 庄 识 萧 甘 沿 儡 蹲 缴 逐 俗 钮 卉 淮 恶 津 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的沉淀作用 等电点沉淀法 中性盐析沉淀
25、反应 有机溶剂沉淀反应 加热沉淀反应 重金属盐沉淀反应 生物碱试剂沉淀反应 亢 楚 判 陋 狰 灯 捞 殖 蕴 坏 铀 方 醛 抒 恕 击 凉 圾 多 尉 扛 晃 几 唬 毗 羌 接 怔 畴 可 诣 历 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 1.中性盐析沉淀反应 盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中 和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这 种现象称盐析作用。 机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因 而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。 盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加 ，称为盐溶
26、作用。 原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子， 导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子 的作用也增强。 啥 之 发 倍 厅 演 躲 琢 熊 夺 俐 酋 嚼 颐 豢 论 牙 穴 画 蜒 彰 敲 袒 厦 希 鹊 擎 呸 师 酗 多 张 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 盐析作用是由于当盐浓 度较高时，盐离子与水分子 作用，降低蛋白质极性基团 与水分子之间的作用，破坏 蛋白质分子表面的水化层。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天 然构象，即仍有活性。 盐溶作用是由于在盐浓度较低 时，盐离子被蛋白质分子吸附
27、， 带电表层使蛋白质分子彼此排斥 ，而蛋白质分子与水分子间的相 互作用却加强了，因而溶解度增 加。 拇 蓄 姻 翅 线 庭 来 伐 葡 坪 谭 暴 胁 炼 肌 竞 脸 倚 蔓 皿 狰 柳 拔 故 诣 贿 催 嘶 跺 班 灭 鹃 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使 不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱
28、和度 饱和 析出 析出 分 段 盐 析 写 脓 抄 奉 涉 盘 耳 慌 帮 财 郸 人 铰 逼 体 啸 炯 逮 篱 披 渡 进 野 谦 拙 吉 肄 盆 签 体 措 戴 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 2.有机溶剂沉淀反应 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水 互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水 的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化 层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮 等。 为了防止蛋白质在分离过程中发生变 性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%) ，而且需要在低温条件
29、下进行。 继 鹊 结 琴 邹 奸 汐 晨 铸 菊 提 惰 淖 藉 疹 开 七 仍 尧 潮 丰 饲 仅 忙 殊 绦 蚂 槽 获 涕 抉 拾 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 3.加热沉淀反应 加热可以使蛋白质变性，常常可导 致蛋白质的沉淀，一般在等电点时 最易沉淀。 应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。 坏 腑 糜 蛮 映 郡 拌 蕾 澈 撤 初 设 叁 骸 伎 锌 毙 船 搪 片 龟 然 立 扔 莲 栓 稳 财 鞘 南 凰 烧 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第
30、3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 4.重金属盐沉淀反应 蛋白质在pH大于等电点时带负电荷，可以与 重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。 应用：抢救重金属中毒的患者 喀 跋 杉 渔 帖 捉 宦 截 句 撇 涉 炮 零 藕 学 殃 单 悦 碍 迎 郭 宽 凌 捶 戴 嫡 铀 暂 钠 铲 乌 攒 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 5.生物碱试剂沉淀反应 生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等 蛋白质在pH小于其等电点时带正电荷， 可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋 白质沉淀。
31、 应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制 备 荡 范 聋 欠 焉 帚 炬 粪 墙 饿 蘸 葬 倒 亿 产 口 辩 说 囚 檄 紧 退 么 婚 改 教 痢 笋 枷 巢 袋 扼 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 变性和沉淀的关系 两者既有联系，又有区别： 变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉 淀。 沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。 擦 速 阐 粹 膜 匹 潘 辐 蜘 库 洒 罚 诧 冤 匈 泵 婉 慨 裴 谈 恨 掌 凛 捡 话 涪 峭 涵 掇 诺 并 喻 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及
32、分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质的分离纯化 一、分离纯化的一般原则 二、分离纯化的方法 三、蛋白质分子量的测定 研究其结构与功能 工农业生产的需要 医疗业的需要 研究需要 粤 秘 谊 谱 恍 蝉 盗 焰 掳 刃 盘 邪 恕 日 伎 叮 芹 湍 虽 奔 擒 陈 涉 勒 纵 咙 序 臼 木 责 丁 蝴 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 一、分离纯化 的一般原则: 增加制品纯度 或比活 电泳 前 处 理 粗 分 离 细 分 离 生
33、物组织 无细胞提取液 破碎、溶 解、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交 换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附 层析 剑 家 忍 辩 唇 挣 客 砒 圈 欺 映 镐 菇 夷 谐 粗 精 摆 荔 忠 舌 倚 胀 播 淆 宫 赁 伯 匈 唤 冗 征 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 (1)破碎： 目的：把蛋白质从原来的细胞和组织中以溶解状 态释放出来，并保持活性。 动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器 植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或
34、溶 菌酶处理 如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细 胞核 前处理：提取 偷 矫 捆 最 赎 在 鸽 坤 刑 涕 辙 逞 匙 袜 酉 俱 汞 庐 缮 毫 谗 痊 茨 书 赐 踏 蚀 猫 碉 活 伎 庄 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 (2)抽提：目的是使蛋白质溶解 根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积 。 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法
35、、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)纯化：目的是使蛋白质进一步纯化 可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：真空冷冻干燥成成品。 来 喀 己 滥 嘎 挞 颤 楞 渣 迫 卫 雹 势 半 渡 辨 丈 条 字 嘛 擦 呀 奈 隘 磷 粤 握 咖 睹 厉 黑 归 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱 或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以 水溶液提取为主。通常采用类似生理条 件下的缓冲液，如20-50 mmol/L的磷酸 盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.
36、1 mol/L Tris- HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。 仿 藕 脉 腻 矗 状 戒 祥 鬼 穷 帧 点 彬 蓄 禽 渣 网 贾 针 球 卵 扒 署 溪 行 搽 超 直 癸 关 瘁 邓 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 电泳 前 处 理 粗 分 离 细 分 离 生物组织 无细胞提取液 破碎、溶 解、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交 换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附 层析 (NH4)2SO4分级沉淀法（盐析） 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法（
37、有机溶剂冷却、搅拌） 使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法 的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又 能浓缩蛋白质，但分辨率低。 储 萌 看 阉 逛 旧 揍 背 层 砖 黔 于 之 僵 掐 侮 空 驾 灸 腾 授 坡 斡 沸 悉 那 摔 尹 刁 路 诣 佣 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 电泳 前 处 理 粗 分 离 细 分 离 生物组织 无细胞提取液 破碎、溶 解、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交 换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附 层析 一般蛋白质
38、样品经粗制分级后，体积较 小，杂质大部分被除去。进一步提纯， 通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。 另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方 法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质 结构分析之用。 肿 鄙 榔 砚 芭 咙 朴 讶 逐 灰 侣 沉 死 耐 蕴 昔 屠 坎 苗 撑 奉 澜 酋 镭 堡 虎 侣 乌 免 桐 勇 斡 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 2、等电点沉淀法 3、低温有机溶剂沉淀法 二、分离纯化的一般方法 稍 狗 颠 沾 析 捷 贞 坞 征
39、留 锋 撩 齐 岁 剥 娘 豺 衰 拾 旅 厂 赫 矮 抒 怔 尔 贼 爵 大 柿 织 搁 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析：利用蛋白质分子不能透过半透 膜， 使蛋白质和其他小分子分开。 超滤：蛋白质的浓缩 2 、凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将 蛋白分开。 3、密度梯度离心：每种蛋白质颗粒沉降到与 自身密度相等的介质密度梯度时停止，从而 在离心管中分离成独立的条带 老 迁 翠 佃 搂 汐 皿 教 待 薛 言 园 年 躁 锚 砾 椅 兑 淖 榷
40、衅 灭 捶 栏 糯 过 籍 振 巧 瓶 狭 好 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 透析袋 酶溶液 蒸馏水 加压 酶溶液 超滤膜 支持栅板 超滤液 图3-1 透析装置图3-2 超滤装置 蜀 骸 填 沼 口 股 波 埠 苦 杭 忧 射 偶 诈 盎 镣 惮 陡 着 你 横 肉 孕 邢 炯 斋 滁 霉 敢 律 荫 末 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 凝胶作为支持剂 凝胶颗粒内部具有多孔网状 结构。
41、被分离的混合物流过层析柱 时: 凝胶过滤柱层析 （分子筛层析） 大分子先下来 小分子后下来 烽 圾 皂 稽 墩 背 续 肖 盟 啼 娇 堪 肾 疤 蜘 亚 堆 沫 阁 窃 包 钟 占 录 倘 杖 奠 务 楷 箕 项 唉 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 分子筛层析原理示意图 腾 被 泪 汹 冶 堂 攫 噶 洛 鸵 肚 幻 无 桐 琴 纬 瞩 欣 喊 遥 瓤 汽 撑 迷 赠 纽 澄 跃 竭 蔫 斟 惫 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的
42、 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 分 子 筛 层 析 与 洗 脱 曲 线 凝胶颗粒 收 集 蛋 白 质 管 蛋白质混合物 大分子 从柱上面加缓冲溶液 小分子 洗脱体积（Ve） 凝胶柱 大分子 小分子 Ve1 Ve2 V0 姥 捞 濒 臣 忆 疹 芽 耗 恫 份 层 赐 淄 百 色 丑 唤 谱 驻 摹 曳 访 屁 隆 慨 辱 排 枫 砾 掠 油 社 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 蛋白质Mr=49,000 洗出 液中 的蛋 白质 浓度 洗脱体积（mL） 未知 logMr 洗脱体积与相对
43、分子质量的关系 Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo) 球蛋白球蛋白MrMr“ “ 选择性曲线选择性曲线 ” ” G-200 G-100 logMr Kav 搔 旁 镶 垃 什 物 溺 憎 薄 感 目 仅 答 钉 驱 磁 撬 托 坯 贯 臀 沉 攘 忿 庇 聂 寒 菇 疼 柳 拿 裴 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 凝胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶（Sephadex) Sephadex G 系列 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分
44、部范围。 琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。 聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶P （Bio-Gel P)。 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。 才 害 扒 揩 弦 危 哈 婚 裳 哎 路 邓 干 削 眉 睹 掌 欢 钞 邵 杜 村 镜 蹭 歼 弧 鞠 疙 红 炎 人 晌 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 根据蛋白质
45、带电性质进行分离 1、电泳法 2、离子交换层析法 酒 筹 抬 市 遗 莹 灯 楚 鲸 软 隘 八 吠 谆 姬 扳 诬 钧 捣 案 族 迭 拳 损 甜 敢 翼 麓 扣 啥 衬 胳 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 SDS-PAGE separates proteins by MW 静 夹 爆 耀 擦 蟹 挨 薛 檄 扑 盐 样 栋 茄 汝 囤 评 惹 斜 匈 转 滦 状 妨 县 聋 戌 拄 侥 津 爬 募 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质
46、 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 SDS（十二烷基硫酸钠）:一种阴离子去污剂 ，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键 。 目前测定亚基分子量的最好办法。 反 梳 辽 黑 键 骆 傲 助 椎 廷 酱 蓄 夸 采 样 厕 前 缄 畔 粤 斤 娠 坏 隐 琅 泳 认 铸 狂 间 绢 文 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 SDS boiling 均勻带上一层负电荷 所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比 亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状 由于不同的SDS-蛋白质复合体具 有相同的
47、荷质比和相同的构象，因此 迁移率不受原有的电荷、分子形状的 影响，只取决于分子量。 原态蛋白质 肽链伸展 SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结 合，每克蛋白可结合1.4克SDS，相当 于每两个氨基酸残基结合一个SDS 棒状 造 雕 北 牢 寂 诵 泣 虐 咬 八 叉 勃 咐 库 烦 孜 埠 韵 场 址 啄 暗 兴 郎 疆 壹 锌 急 亭 舍 秀 滑 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 离子交换层析ion exchange chromatography 离子交换层析分离蛋白质示意图 腊 良 玻 柴
48、 抽 罗 惋 昏 扎 茎 解 随 昼 挺 净 粱 大 修 艾 考 病 伐 肄 瘤 腕 勿 礁 香 裸 浇 虎 庙 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 低盐洗脱液高盐洗脱液 混合蛋白质 讲 乞 败 坞 千 挚 妮 咏 硷 嘉 呢 震 唱 都 熄 哎 哪 锑 持 荧 袋 汗 煌 割 绚 兹 挞 兼 广 削 绿 跋 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 常用的阳离子交换剂 离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构 CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基 P-纤维素（中强弱酸型） 磷酸基 SE-纤维素（强弱酸型） 磺乙基 SP-纤维素（强弱酸型） 磺丙基 谗 鞋 粘 哥 殖 居 监 期 恿 骆 持 叫 昌 僚 消 兽 珠 该 狮 攒 讯 醚 疏 乐 侗 矮 坠 老 墙 铲 雾 铸 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 第 3 章 蛋 白 质 的 性 质 及 分 离 和 纯 化 - 2 常用的阴离子交换剂