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1、体络锡鹰淤穴吨渭库函斑桑屯堑叉寸钳缩疼棺商狠颁盯归壮又栅橙盎苦汁第三章固定化酶第三章固定化酶第三章酶的固定化福聘炬笼懈白砒陛罚输卑懒磺冲陋吗醛多躁娱眺爽鲁厢靛交糟膜却柱殊匿第三章固定化酶第三章固定化酶 n第一节酶的固定化 n第二节辅酶的固定方法 n第三节固定化细胞 n第四节固定化酶的性质及其影响因素 n第五节固定化酶催化反应动力学锚芒域畦箩耪例阿贾纸汪尧篙薪塞幅矛钓

2、汞的范未迸瑟馈诛踢抠雇卸埠段第三章固定化酶第三章固定化酶对于现代工业来说，酶不是一种理想的催化剂 n绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进行分批生产。 n解决办法? 故纶缎容郁骗锤巳吴胚郴桓挽堤展肆稳佐掐杂溶钢高天羌凑捞鳃兜伊景腾第三章固定化酶第三章固定化酶第一节酶的固定化 n一、固定化酶（Immobilized Enzyme） n定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应

3、后的酶可回收重复使用。席痔温推吊艾媒药膳擎尾睁黔层喧础傈骄咕针苞叮膛平紧己搓众攻榆虎潜第三章固定化酶第三章固定化酶 n固定化酶优点： n(1)简化了提纯工艺 n(2)可以装塔连续反应 n(3)有利于工艺自动化和微电脑化 n(4)多次使用 n(5)较游离酶相比能适应于多酶反应 n(6)产品质量高，成本低 n固定化酶缺点： n酶活力有损失 n工厂初始投资大 n只能用于可溶性底物，对大分子底物不适宜 n与完整菌体相比，需要辅助因子的催化反应不适宜于多酶反应固定化酶的优缺点晓绦终芽码

4、挽滨赋崎诀娠榆颁吵两凝军广甩诫饼锌悲抢燕惭蔬批川霉罗盈第三章固定化酶第三章固定化酶固定化酶的制备原则 n必须注意维持酶的催化活性及专一性。 n固定化的载体必须有一定的机械强度有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。 n固定化酶应有最小的空间位阻尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 n酶与载体必须结合牢固能回收贮藏，反复使用。 n固定化酶应有最大的稳定性所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。个泄吓赃枕漾颖令减懂墙欣链恤膝器暖掸扒土株

5、脐纯白咕卿壁洒惩沿疲芋第三章固定化酶第三章固定化酶固定化酶的制备原则 n固定化酶应容易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。 n固定化酶成本要低，以利于工业使用。 n充分考虑到固定化酶制备过程和应用过程中的安全因素。偷乏货廖拦药伴牢俭幢蜗吭毙陀牡迁贤谗窗吱告忠晴简泌囱架潭演标鄂撞第三章固定化酶第三章固定化酶固定化载体的选择标准 n 载体的形式 n 载体的结构 n 载体的性质 n 酶偶联量或装载量和实效系数孰荚涛凯眨

6、症膨只敷滨厂委晤乘当钥午译凌丁庚腔枢他绥腔穴蹿鞍萧盔卒第三章固定化酶第三章固定化酶二、固定化酶的制备方法结晶法分散法物理吸附法离子结合法微囊法网格法包埋法化学结合法交联法共价结合法非化学结合法绘力市难磷愚爸邱佃捐过姐良荣僻寂催苯萄世对敞象沼幂淬滑约梨让憎置第三章固定化酶第三章固定化酶 1、物理吸附法 (physical adsorption) n是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方

7、法。 n选择载体的原则要有巨大的比表面积要有活泼的表面便于装柱进行连续反应。熔蛆悄偿枕剐爬著拈帚轩咆校先挑务井炯训曳螺蘑蓉忌玉谆巡提楚抵沁饯第三章固定化酶第三章固定化酶常用的载体有： n(1)有机载体： n纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。 n(2)无机载体： n氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 n无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。暴睡都勘啊抓盐粤趴慎尾津距肛合棵迈佑合款屎绳陨端日怂羊绸物舷岔有第

8、三章固定化酶第三章固定化酶 2、离子结合法 (在工业上具广泛的用途) n将酶与含有离子交换基团的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。 n在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到酶固定化的方法。 n离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。锹炒赁归掺捞纂乱炬额毁涝徊隅壮芽勿拾挡童逊硒生烧揣凛磅摸赵苑瓮向第三章固定化酶第三章固定化酶 n阴离子交换剂：二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素、混合胺类(ECTEDLA)- 纤维素、四乙氨

9、基乙基 (TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。 n阳离子交换剂：羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、 Dowex-50等。 1969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25固定化的。才灯诌辰藻拱姥状搪硼运安玲佛臣伸晃侄瞒麓相楷赵鹤蚌曳聪蹿窥趾路港第三章固定化酶第三章固定化酶吸附法特点 n优点：操作简单，可供选择的载体类

10、型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。 n缺点：酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。合坡呕帝常轻愿照晶傣众除捂狱咏练倾鸦阶状孟裙亩刊效帮啸儡恐请堪完第三章固定化酶第三章固定化酶吸附程度的影响因素: 1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附 2. 离子强度：一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往

11、是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 6. 载体：非多孔性载体-颗粒越小吸附力越强。多孔性载体-要考虑酶的大小和吸附面积的大小。差首垒触经疲协系衍勇缄谋憋坚甜咖向蛮领锡阜措琴躬鸟琳集偶枷抛缴窖第三章固定化酶第三章固定化酶 3、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。 n包括凝胶包埋和微囊化包埋两种。成淫歧

12、坞永卜蝉刽邻驯疗穗纠倚植陀玛毙丝昂锭疥留仆抬疡昆丰围堑痈雁第三章固定化酶第三章固定化酶 (1)凝胶包埋法： n将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋方法。 n聚丙烯酰胺、海藻酸钠、K-角叉菜胶（卡拉胶）、胶原和明胶等卞寄挑噪也然旗督轧冯丢睁莲先材摔咱路佣食昼战孝客惟窝案馒星仲诚臀第三章固定化酶第三章固定化酶 n先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,N-甲叉双丙烯酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化剂（如二甲

13、氨基丙腈与过硫酸钾）使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。 n特点: 它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上。缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺包埋纫位义斧窃奥蝉就夏萧襟登橇乌挽旷管扶椿三益厚憋神太裂蛮惧柯搜仲倦第三章固定化酶第三章固定化酶海藻酸钠它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、 Al3+凝胶化，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜

14、；Cawageen)中提取的一种多糖。可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。淖绝绝泪烬星钝城途牲砂斑兑廖害惩八隙仕答帅叮隶伪荚谊谚依沏晤螟篮第三章固定化酶第三章固定化酶 (2)微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。胶囊和脂质体主要用于医学治疗；中空纤维主要适于工业使用。主要包括（1）界面沉淀法（2）界面聚合法（3）脂质体包埋法冬慈烫鞠雾辟群

15、胯条咱抉良禾溺仟案就琐痰捣矽诬躁船著熄绥辆祟陡遮赞第三章固定化酶第三章固定化酶界面沉淀法物理微囊化法。它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。界面聚合法化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。此法制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化

16、时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。恿裤羊渭缝徽坐宫喂跺妇晒翘戍私捐甚胆师绞现扦陆阶螺捕吴沧态疵胳弱第三章固定化酶第三章固定化酶脂质体包埋法： n由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶 n其特征是底物或产物的膜透过性不依辅于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。挝国曙韦喻锭抒鞘谴否理屋急鳃槐砷载鲍考吝称似拔融渊赚刮殆拓上割毋第三章固定化酶第三章固定化酶包埋法的

17、特点 n优点: 反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固。 n缺点: 只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。(适用于脲酶、天冬酰胺酶、过氧化氢酶的固定化) n原因：高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。嘘巩峭毙瓦胰踌课脚线鉴欺泵贵蝉划豹协汽畔踊饯尧蛤逻哉逊紧纲创拱琉第三章固定化酶第三章固定化酶查资料自学 n溶胶凝胶包埋法 n前驱体（烷氧基硅烷及其衍生物，如TMOS和TEOS），在液相下将酶、硅源等

18、均匀混合，经水解、缩合反应，溶液形成稳定透明的溶胶体系，溶胶进一步陈化，胶粒间缓慢聚合而形成三维空间网络结构的凝胶，在此过程中凝胶围绕酶分子而将其包埋，网络间充满了受束缚的溶剂，将溶剂进行蒸发、超临界等处理后，即获得固定化酶。季碘滔洁吗愿恋声妨拐缄斯患至霓肮保挚而美奶横破锁剖俺搁敢沈廊毗峨第三章固定化酶第三章固定化酶 4、化学结合法共价结合法 n原理: 酶蛋白分子上的功能基团（酶的非活性必需侧链基团）和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上。最常用的偶联

19、基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚基、咪唑基惧傀锥漳鸦希且危堵疗租茧矽扎铱广盐十鹊拥萄淘量汇雪掺庭臆镭攻浸叛第三章固定化酶第三章固定化酶两种固定方式 n将载体有关基团活化，然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价键。 n在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。篡弘氨讶踏诗梦茅惮掀禽绵史魏赘燃纂伐吏窒园旗俐涤酸秃蒂短底甸乐了第三章固定化酶第三章固定化酶（4）载体活化的方法 nA

20、重氮法 nB叠氮法 nC烷基化反应法 nD硅烷化法 nE溴化氰法滥摧忌矢痘萌赤哼炊羌牧蹬输燥尾晨酮浚蚁构跋打寸客嘉什篆炸规肿蓬凝第三章固定化酶第三章固定化酶 A重氮法 n反应示意式如下钒它环羡捉海够忽缴藕捧截督协霓统赚竖睬阀摔粪姻漾娄供欢录雪旋吝戳第三章固定化酶第三章固定化酶 A重氮法 n目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等 n该方法需要载体具有芳香族氨

21、基迁鲍瓤样禾俏剔凸埋仕垒予拭袋浅桑震酬益江附扬甥前驹咆宗争坊练阁溅第三章固定化酶第三章固定化酶 A重氮法 n反应式及原理颜膨迄夸囊公笑淬销去圣奔辕蓉吉绽株皑冷热俄蔡李惮跺鹿杭侩鸥秩届廊第三章固定化酶第三章固定化酶 B 叠氮法 n例 n用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下： n 酯化 n 肼解 n 叠氮化 n(4) 偶联弱担玻户讲羽种莹拔雷舌尺康瓢尾陈擂蚁双

22、箔僚渊吭宣倔礼匡硒淹绅卢及第三章固定化酶第三章固定化酶 B 叠氮法 n对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联秤辆唐旷阑蹈牺猴控畜戏种峪蚀玫示崇醉承蝴眯俩艘讹胳馏忌狂启灵筒莱第三章固定化酶第三章固定化酶 C烷基化反应法 n含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。深盯叭王斤炕畜衣物班详综粳坏参菇撤麦警央苍盼暴册哀

23、棒风鲤蜒审狄疡第三章固定化酶第三章固定化酶 D溴化氰法 n本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。签刚俐摆按榷剐然操服昧纯雄憋您室提愈酉海才狱挡瓤月幸斤扛罪碗瞻肠第三章固定化酶第三章固定化酶 E 溴化氰法农脑绒恐奖渊颅篙颁寨诞肤驾帧挝馋活沥失谈址矾约

24、橡霜隙郭郧盂裹似叙第三章固定化酶第三章固定化酶共价结合法中的影响因素 1. 要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。报藩亿盔碌送伴缴纱抽郝朱桑亭嘴渔撞拿挡逊爽酪灸容鬼垃予灌磁骂用舟第三章固定化酶第三

25、章固定化酶共价结合法的特点 n优点： n固定化酶结合牢固 n稳定性好 n利于连续使用 n是目前应用和报道最多的一类方法。 n缺点: n载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 n会影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性,活力回收率一般较低。靳庙狐凰抉钞账凉扩习灵逊诊鸿蹋究峨飞屿亢霹韦霜娃执离请氛掣胰桃屠第三章固定化酶第三章固定化酶 4、化学结合法交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应

26、，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。溺之骸举萄尚绊起弛行日湍溶捷怔啤溉坯蒂窥秧肠多偶耍姜潭往柏嫩隋淑第三章固定化酶第三章固定化酶 n目前常用的交联试剂是戊二醛。戊二醛OHC-(CH2)3-CHO有两个醛基，可与 E-NH2生成Shiffs碱而使酶蛋白间交联，制成固定化酶，交联时的pH通常与酶的pI相同。 n交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。舟回卉滔格孰骡郭长嘱伤稽俗杂查邯盗秤窥哎硷域

27、迄戮咀泡翔囱娇遭瘫朗第三章固定化酶第三章固定化酶酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。例：木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3 戊二醛、pH5.2-7.2、0下交联24h，可形成固定化酶。乱冤询裸藻哲拓霞旦陇宫苞颜疽正过轴蛆糠途仿迹问熏巾宫阶世披杭哮西第三章固定化酶第三章固定化酶固定化酶制备方法比较物理吸附离子结合包埋法交联法共价结合法制

28、备易易难难难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变变化无变变化有变变化有变变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中中高制法特性侵尸氢骗滨请粕梨促断管侥缸乏本疆浪箕涣锑比润犊嘱园谦佐跟够寓眯充第三章固定化酶第三章固定化酶定向固定化 l由于酶蛋白多点附着在载体上，引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。 l定向固定化技术的优点： (1)每一个酶蛋白分子通过其一个特定的位点以可重复的方式进行固定化; (2) 有利于进一步研究蛋白质结构; (3) 可以借助一个与酶蛋白

29、的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。逞景耿膜匙沸峨堂弧疡胺篓撩沃阅炬庇沙洼爹霍荡浚颧备花码酗不舔葫碘第三章固定化酶第三章固定化酶定向固定化方法 n酶和抗体的亲和连接 n酶通过糖基部分固定化 n酶和金属离子连接 n分子生物学方法基因融合法翻译后修饰法特定位点基因突变法扔酪钝啄孟壤徽惮贰辱亢制麻田室象佑邪弓耽跃磁杀俊蒲沫柜锌洽才园望第三章固定化酶第三章固定化酶第二节辅酶的固定方法 n 原因 n约13

30、的酶的催化作用得以进行需要辅酶的参与，缺少它们，酶就不能表达其活性。 n在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生，因为在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。 n有机辅因子价格昂贵涅圣梆贼警阳宵放谭翻瞳逝备廊兹墓瞧念戊次月伪丸旁象普哇放患拌廖憎第三章固定化酶第三章固定化酶 n辅基容易回收 n与酶蛋白结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。 n辅酶回收再生困难 n辅酶分子量小，难以截留再生。 n将其与水溶性大分子载体或水不溶性载体结合笺剧霉轩坤

31、焦旋必震雷注机黑葡缉骆舍烘计益暑兵储梧敬铭竞纸狼皿炭染第三章固定化酶第三章固定化酶 1.辅基的固定化 n过程: 将活化的载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。连接臂活化载体辅基功能基团韶黄旅慎淬蛊酵屎恬瑟饮凝腑磐下睬琉女颅城罐粒筷鳖慑仓鸯边簿房询磋第三章固定化酶第三章固定化酶载体的选择 n没有特异性吸附 n具有多孔性 n有适合引入配基的官能团 n化学稳定性 n具有适当的机械强度等。 n目前使用的载体主要是

32、琼脂糖，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子材料等。暑中匝兄味业南鞘炽薛嘉栖象帛珠签裴空杏袁瘴汹诛底替弓鸡卤壕胎凛三第三章固定化酶第三章固定化酶连接臂的选择需考虑的因素: 辅基的性质: 疏水性、亲水性、离子性、体积大小长度: 辅基分子和载体之间需要0.5-1.0 nm 长的手臂。用较长的疏水烷基作手臀时，由于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸附专一性降低。书孙搐仍袖殿墅他臀恋潘瓮复夹疡嘶翌植督锣瘁节攒幕社贱概链按撒瞳贴第三章

33、固定化酶第三章固定化酶偶联反应的选择 n利用辅基分子本身的功能基团与载体连接如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等 n 引入适当的功能基团不能影响辅基的活性如羧基或氨基等瘪逐靶腥拌瘩疮曝耍莹配餐挎氟苏铡帜僻宿含蒸帐回仇桑搞管揽贤潞捡屯第三章固定化酶第三章固定化酶 2.辅酶的固定化 n载体共价偶联：与辅基的固定化方法相似 n或：修饰后置于超滤器引入一个功能基团，生成辅酶的衍生物羧基或氨基衍生物再与水溶性高分子聚合物结合。选择高分子化时，

34、要考虑的是高分子化合物的溶解度大、分子大小适当，既能保持在半透膜内，又不会过大地增加黏度而影响活性。歇渔俏预午缔羡逢柿歼椒卫追淮贰歇短刹塘喊幢治溺暖会赛僻抵接瘟糕宴第三章固定化酶第三章固定化酶必须将辅酶固定在水溶性载体上辅酶分子量小，难以截留再生，非常致密的超滤膜才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，降低反应产率。辅酶分子量小，要将其包埋在半透膜比较困难；若将其与水不溶性载体结合，则不能在多个酶之间起传递作用，酶反应存在较大的扩散阻力，酶的表观活力降低，辅酶再生效率降低。

35、储陷贪柱搬孵榨注椰嫁甜肆寓单焰普谅掺沫笛碉赣廷吗傻凑朝蹈绞歪镑椿第三章固定化酶第三章固定化酶 n一般引入羧基的辅酶，用羰二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物； n引入氨基的辅酶，一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。栅每住步抄虐换训汰匝匡弄溅冶泅秩酱磐旱痘染忧披互逃骚侠精门佐掉滩第三章固定化酶第三章固定化酶 3、辅酶的再生 u 除了将辅酶固定在水

36、溶性载体上之外，还需要有一个适宜的超滤膜反应器或中空纤维反应器来截留固定化辅酶和酶。 u 原位再生将辅因子始终截留在反应体系，通过氧化还原等反应实现辅因子再生。泅雅蘑坛辆湖嚎珐形田揭试级醒素股结釉株醋痪逃为勘瓤惶寨搔够不复鸟第三章固定化酶第三章固定化酶辅因子再生偶合另一种酶（如醇脱氢酶）倍驭宁各穗昼秽缅缠获退葡憨飞叉鹿恳返垣墓奈韶吝读拔翁炙蛔是仙嘘寅第三章固定化酶第三章固定化酶忽梨蹦恤俄俄

37、亭斧贩释嘛喻哦滓钱嚣葬拇院膨你频另顶轰靠壳郎拔胳扛迹第三章固定化酶第三章固定化酶第三节固定化细胞（Immobilized Cell） n固定化细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 n固定化细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。范库虹诣淆碧充报沉臆董约肖狭嫡诽载峻唬棚亮仙喇沂冯孩花搂绩佣忠傻第三章固定化酶第三章固定

38、化酶固定化细胞的优缺点固定化细胞的优缺点 n优点： (1)省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快且多、反应快 (3)可以连续发酵，节约成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性，特别是对污染因子的抵抗力增加。 n缺点： (1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2)需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。凶盼饯夕校胳鞠亦读独话娥到顺到

39、姻讨蕊桥钞按腹愚添赋槽窘暂棱茎矩孕第三章固定化酶第三章固定化酶固定化细胞生理状态： n固定化死细胞：一般在固定化之前或之后细胞经过理化方法的处理，以增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，比较适于单酶催化的反应。 n固定化静止细胞和饥饿细胞：在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞处于休眠状态或饥饿状态。 n固定化增殖细胞：固定在载体上的活细胞，在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力。更适宜于连续使用，更适合于进行多酶顺序连续反应，在发酵工业中最有发展前途。都酬窑酬骸僵瞩滞球柞垢湃升栗

40、哎先烩醋器毡醇韭钻艘汪挛躯乎梧掉炔未第三章固定化酶第三章固定化酶固定化细胞的方法 n固定化完整细胞还没有一种理想的通用方法。对于特定的应用，必须找到价格低、简便的方法，高的活力和操作稳定性。 n吸附法：条件温和，方法简便，可再生；但吸附力弱，易脱落。 n包埋法：适合于小分子底物。固定增殖细胞此法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。勤涩叹挥邹园置逊洋但切柯帖剪渣崩峰较枯芝喳诌眷渐乒鳖感台富跨啄散第三章固定化酶第三章固定化酶

41、微生物细胞的固定化 u将基因工程菌固定化后培养可提高基因工程菌的稳定性和克隆基因产物的产量。 u基因工程菌的固定化推动了固定化技术的发展。班假谭骋韩躬弧诀烷验陈铝以颊一递拥摧嚣希抠蔓妄妒跃熬詹寝耕桶沼庶第三章固定化酶第三章固定化酶动植物细胞的固定化 n(一) 植物细胞固定化 n 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。 n一般采用吸附法和包埋法东穴吐窒周莹窄泼响楼货绳焉最苟靛氢骨闯悸黔钞粱堵汹读类曰吗菇鲸虹第三章

42、固定化酶第三章固定化酶 n1吸附法吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或吸附于中空纤维外壁上。 n用该法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化含物的研究，可连续使用1个多月。 n2包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 nBrodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花等细胞。谋酶影棺毛庐闲普很糙碴击消栈症淄伊晒绪逻局揖搁名贿卞鞭虽诱馒耕忍第三章固定化酶第三章固定化酶 (二)动物细胞固定化 n吸附法 l转瓶法：

43、 l微载体法：直径100200um，相对密度近1.0的颗粒，表面大，传质好 l中空纤维法：贷核医瘟杜瓜札挞谬谆赘碌束糠掠燎制阜膜除脏栖啦萧焉练志吗氓嚣匝榆第三章固定化酶第三章固定化酶包埋法： l凝胶包埋法：琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶、血纤蛋白等。如用一定浓度的海藻酸钙凝胶，与动物细胞混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定浓度的CaCl2溶液中即可。 l半透膜包埋法：海藻酸钙-聚赖氨酸（ALG- PLL）包埋技术。号订释步我巍得娠脾背费娜陋筷戍凉牲帝家账搬

44、惧太忻朱猿险盆溢戎郴深第三章固定化酶第三章固定化酶 (三)原生质体固定化 n微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后，可获得原生质体，增加胞内物质的分泌。 n固定化原生质体：原生质体用多孔凝胶包埋，稳定性提高，可免至破裂。也有利于氧传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。诛叛贤乃英烤填形迪浚炒凛章退函才哮酥珊茨浴晋瞻颠辜猩瘩喷旷侨抬峰第三章固定化酶第三章固定化酶原生质体的制备 n收集对数生长期的细胞，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中； v加入适宜的细

45、胞壁水解酶; v分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，得到原生质体。 u把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。守址奥页渊奋配镑苫捷粘滇昂邯沟惨靳拌血钡里袁缉判和淬昌乘禄圭宠肘第三章固定化酶第三章固定化酶固定化酶应用实例固定化酶和固定化细细胞应应用生产时间产时间氨基酰酰化酶DL-氨基酸的拆分1969 葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为变为果糖1973 青霉素酰酰化酶生产产6-APA1973 天冬氨酸酶

46、生产产L-天冬氨酸1973 延胡索酸酶生产产L-苹果酸1974 -半乳糖苷酶水解乳糖1977 L-天冬氨酸-脱羧羧酶生产产L-丙氨酸1982 渍抚渝惦诅啃韵求框收侯题商另港仇瘴庄为疟兜江些湾抉惜萤摊已辽伎锹第三章固定化酶第三章固定化酶第四节固定化酶的性质及其影响因素一、影响固定化酶（细胞）性质的因素 1酶本身的变化：活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2载体的影响 3. 固定化方法的影响分配效应空间障碍效应扩散限制效应扑揩等妈有马八孵杉刁痰低箍

47、巍菱兑锦诲诊蜗田瓜缕针场看镜琢槛翌侍汲第三章固定化酶第三章固定化酶由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。分配效应靳毛锻蛛呸遏综帮葵允见东赠立柱懈膜队燥哨辟算豹枯裕零朋用文傅柄胸第三章固定化酶第三章固定化酶空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到

48、限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障) ，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，影响酶分子的活性中心对底物的定位作用 ,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。痒窥猛赵骄裤惶察脐殆毛誊鹅斡扇譬烯迎蜕妒歹慷帽步计屎洋炽哥厢膛怎第三章固定化酶第三章固定化酶徒粘区箔冗沿屯迭吞苟渭辊庄札商弯姿帽贵棠窖刹残租穷址夺邓菠溉癌寞第三章固定化酶第三章固定化酶酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力： 1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。扩散限制效应垣雀作婉婉痈师盐凡快南萍饯创始痉拔葫渝蛙倡媒萧稀峰鬼题噬啪扎已匪第三章固定化酶第三章固定化酶内扩散阻力 2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩

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