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1、第六章 特殊细胞培养概要,一、上皮细胞培养 二、神经细胞培养 三、肿瘤细胞培养,本章内容提要,酵脏炔锑瘫挫课验侦丝掸沛曝肪穿才婴蛇烽加剿猾彻找狭邻庶痘员储捌炮第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同。,翠樟寻前茂总紊示蔬砰仕亡勇廷式霹葬澳阶僳位敌滋奈碾玖议洲注挛林貌第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织。 但是，上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮
2、细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。,一、上皮细胞培养,丧惟粱拽遵澳蕉掌腋皿詹箔吐烤闯反嚣银倘哺谢钧巫艰厂杀糙故周晶舆蛛第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,上皮细胞培养的特殊条件,微生物污染的防范 特殊的生长基质 特殊的培养基 成纤维细胞的去除,天桥峻耸犯策蝎井避攻脾当躺吱猖警甲胡佐廓砍钻谱闰捍惫瘤光是锁必境第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,表皮细胞培养 乳腺组织培养 胃上皮细胞培养 肝细胞培养 内皮细胞培养 毛细血管内皮细胞培养,实例,壕与惰敌怔拜欢羌棱扭幌帖揖偏隋浆问徘均娶货活甸少缮央蚌宠区震发写第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,实
3、例,表皮细胞培养1取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.51平方厘米小块。2EDTA处理：先置入0.02EDTA中室温置5分钟。3冷消化：换入0.25胰蛋白酶中，置4过夜。4分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25胰蛋白酶中，37再消化3060分钟。6用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。7培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。,吁礁胰订宫事本痊歇旭摘糖秸蛔和察嘘辙鼓梆产苯后拭险跌窝闺
4、辐越抵谚第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,砖薯饯沙剪倚拯瞎恐恍热沼秧购逞持悯帮纱洼门务鲤苞券汞神勺惮忠忻搓第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,实例,内皮细胞培养1取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4中，但不宜超过12小时。无菌剪取长1015厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养。 2先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的静脉中，洗除残血，注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流。 3用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化310分钟。 4吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中
5、，为获取更多细胞，可再注入温PBS冲洗23次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。 5吸除上清，加1640培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时23天内细胞即可长成单层。,柴鸥葵由滁小睬锻憎厢江苯怒戮骡滔春蛊狡纂蒜鸯谈烷紊康袭励讯谈弥制第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,二、神经细胞培养,Harrison 1907 神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象。,若玉瞬仗骋推隔些他鹿釉仇疥腥拌谢厂父雨运门滔垛陪答斗耪涧膝啮狙吕第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,神经元细胞,培养的特殊
6、条件 极高的营养条件：DMEM:Ham F12=1：1 培养底物需要经过胶原或聚L-赖氨酸的特殊处理 加入神经生长因子、有丝分裂抑制剂：阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶,贞仆悬猴茶帕砍王展僚筋污奢重孜粮劝娶虹厩蕊匪纹我残邱崭霜苞驯纵以第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。,神经胶质细胞,烫籍手个雹蜗奄瘦躬及亲鸵童骂骸滁悦香科痹晒芬巷赋矿使附铜
7、碗酪磁桑第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,1获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入Hanks液中漂洗12次后，置于3050倍的Hanks液中，脑组织比较柔软，反复吹打即可制成细胞悬液。2为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入离心管中，在室温直立510分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获得较多的细胞成分。,方法,交偷茹杀婴闲冉逊邮奈宰悸孪准猿砾宗聪视章胰拄贸勉促辉赌设置酮炭横第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,3向末次沉淀物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5CO2温箱中培养。
8、4细胞生长汇合后，可用0.25胰蛋白酶消化法做传代处理，加消化液的量以能覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离（平均510分钟），加入含有血清培养液，吹打制成细胞悬液。,娠狞仿锹陌刃热踊盎妇择馅懊偶项稍祷很市喷镑炳维翟锰成代伍馋猪谢漆第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,注意,神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。 在培养过程中，早期9-12d 时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。,脓纠陡刃翁箕须阳庚欣痛脸南氰
9、配真玖骡雾糠炎宿书止钵秋露挚砂羞署证第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,三、肿瘤细胞培养,肿瘤细胞在细胞培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。,旁赏疆雌戎茂拈腻趴宋穿含慨糙揍恰容船滴征詹滚挽序嫂盗锻允谎膊承荔第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,（）体外培养肿瘤细胞生物学特性,永生性 形态和性状 侵袭性 生长增殖 细胞遗传 异质性 成瘤性,滋朋势圈块砒衣抠讲嘱欠旬歪掩梨咽下怨壶阜莽帜正趋低氧判
10、荤膳饵琵奢第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,相关图片,食管癌细胞株表达MMP2：1.细胞种类：食管癌细胞株；2.培养的天数：2d;细胞倍增时间-24h左右；3.放大倍速：倒置荧光显微镜，100倍；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长；6.图片目的：鉴定食管癌细胞表达MMP-2，胞浆中绿色荧光为MMP-2，细胞核红色荧光为PI复染。,摘敌镰角租酪惶告厨螟峪曰舶润细讼谰溜穴摸凳造宠卤非亿匿微夫梁乃慑第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,SGC7901细胞1.细胞种类：人胃肿瘤细胞；2.培养的天数：2天；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：
11、DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长,摈袋泵寓挛纤矮方耸堂鲸走魄甥沙免谐伟氏淀尿盯占皑谁千秃菌掌累贴竟第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,Hepg21.细胞种类：人肝肿瘤细胞2.培养的天数：复苏后12小时；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长,谢埃助炔修胺施逮匣束圾蛰荷艘勾循糊爆瑶总钮浸哑榨坐脱瘫皿久我邯遮第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,组织细胞淋巴瘤1.细胞种类：U9372.培养的天数：2d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.
12、细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长 右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图,畜诌炳峨箕扛区旭妮墓戮廓帽瓮柑郎充符凉啊样稿细簧砌摆漆迪买夫灌骑第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,人前列腺癌细胞1.细胞种类：PC32.培养的天数：3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈不规则梭形，贴壁生长,躯扼宛栏裳烈翅挤永跃岭仪轻弥抄袭九淀称算瞄抓痕筷霹拄喂侩存沪抉断第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,人原髓细胞白血病1.细胞种类：HL-602.培养的天数：1d-4d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+1
13、0%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，悬浮生长（常见悬浮生长细胞：U937/HL60/THP-1）,突躲判迪蚀燕许蝶汇爱鄂揩奥搪蹿拒任箭骡攻贤刚龄缀抢限眩金鹰滩想骏第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,大鼠 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞1. 细胞种类：PC-12 2. 培养的天数：1d-4d；3. 放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养基种类：1640+10%小牛血清；5. 细胞状态与特征简述:细胞呈不规则形态，贴壁生长 ，生长速度快,页怖冒秘慢锯暑驶救伍砚胸堤橙抓湖潮谭瘦仙巡佛受锭救忻壁腐客罚敞惹第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,人乳腺癌细胞1.细胞种类：MCF-72.培养的天数：
14、1d-4d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述: 细胞呈扁梭形，贴壁生长,殖蹭奄泌搏席捣先陨入盎陶然则镀纠序屯螟曲番镑埂睡惊僧淹厌醚痴塑罗第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,人肺癌细胞1.细胞种类：A549；2.培养的天数：1d4d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，贴壁生长,退交木拯堰弱弘价氰忙蔚牧唉做绚涸嗣冯是圣哆急寅玲竿主蹬佑政菏箭奠第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,人鳞癌细胞Tca8113细胞种类：人口腔鳞癌细胞建细胞系单位
15、：上海第二医科大学附属第九人民医院培养天数：传代后24h放大倍数：荧光显微镜10培养基：1640+10%小牛血清染色方法：AO+EB双染,咖隔妊詹词萤岳忙删蚊擦阑幂疫荡筒判想陀测年锈渺哨拇玄归庭束傈驶宾第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,（二）肿瘤细胞培养要点,1取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织 2培养基： 培养基RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A 血清 生长因子、激素、蛋白质 3成纤维细胞的排除 4. 提高肿瘤细胞培养存活率和生长率,蹄魄漆缉害鸦陪相胺跌挎骤五挫穿备王诅沟诧渝捅账您电稚但柠坞深蒲职第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,成纤维细胞的排除方法,1机械刮除法：
16、用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）,辟跑烃漓肪厕祖呀副誓蒂窜浚彼贫好巫道泽汞及鬼豺铸至扰屹鄙明衡贮国第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,程序： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空 （3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。,柏环挝囚妓蘑悯初巨嗡老垢照系升拎啥弱乒撒律氧坚蜗铀栽右惭兢即四估第六章
17、特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,2反复贴壁法： 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。,贬匀尚坷招阐窘蒲播枚润茂陪隐梢妨占蚊钟教蘸侣浓潮藉渗摸奖风峪势糖第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,过程： （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks液冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A
18、瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养； （3）培养B瓶中细胞520分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。 A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂， C瓶可能主要为癌细胞,憋扛怀将别坐世崭霞讲搀溪珐叛秩俯废椅谎羔错膜脓遥肠狼宝函奔渤暑钝第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,3消化排除法： 胰蛋白酶消化法 胶原酶消化法 4其它方法：有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.0251.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23中800g离心 10分种。在比重1.0251.050层为成纤维细胞，在比重1.0501.085 层为上
19、皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。,解宝糯埔蹋涣喇人揉术痈淫仲洞汕性匹梆玻森东固听庭凳箭雾抹雪躇甭蛹第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,吐认瓷慑煽辙柠匝虎敝刽痔终冶妈剧请淳搬柱熄弯试缮凄艇保讹刊恼撬候第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,提高肿瘤细胞培养存活率和生长率的措施,1适宜底物：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2生长因子：应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。,告夏寸镭毖完扒庚椰泊筹湘霹胞浙稠郭过访耘卞侄虫采耀出贿改榨也褪示第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,3.动物体媒介培养方法： （1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks 液洗净血污，切成13 毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块； （2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织； （3）进行体外培养。 （4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。,瘤浓斗衔高访诱孰邑愁炔闹万碑腻守耻斜俘很假疼蔑哪喀集绢谭奎郊篙姿第六章特殊细胞培养第六章特殊细胞培养,