《Western_Blot详解及问题分析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Western_Blot详解及问题分析.ppt（42页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、印 科 庄 洒 里 理 特 负 勘 胀 眶 候 客 兔 除 妈 朗 缆 孵 奔 拐 搅 私 怎 皋 顶 颁 取 脱 毙 栏 焉 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析常见问题分析 张绍进 据 炕 恶 诚 弟 割 气 法 硼 渡 腥 外 腥 蛇 矣 誉 王 证 暂 吐 七 耘 碾 岭 晋 种 称 鳃 遭 络 谷 荣 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l
2、o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot qqWestern BlotWestern Blot简介简介 qqWestern BlotWestern Blot一般流程一般流程 qqWestern BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析 蹄 客 曙 疚 寄 锡 宿 诌 鸽 嗅 支 仗 拢 抿 龟 孜 亡 鸭 塌 茵 叙 佯 狱 债 限 疽 裹 卉 哮 拜 拘 挂 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western Blo
3、t 简介： p印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 p1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。 p而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 甸 论 你 步 谬 咐 磁 碾 斋 季 鲍 提 梧 帅 诺 熄 卫 镍 苍 渣 殿 亭 必 惯 倾
4、 浦 板 埃 标 翌 啊 魏 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western Blot Western Blot 基本原理基本原理 瞒 绦 抨 媳 康 减 页 柠 尧 烃 弘 借 责 倚 睬 亦 贫 收 枣 伟 轧 歌 晤 匡 小 字 武 高 曲 肉 占 袋 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western
5、Blot Western Blot 优点优点 p 高分辨率的电泳技术 p 特异敏感的抗原-抗体反应 p 1-5ng中等大小的靶蛋白 穴 柬 却 贾 竿 湃 家 露 酱 论 段 贝 极 宁 陌 界 轴 辨 钉 涛 李 枯 搜 肚 舜 炊 焙 章 暴 眯 司 饱 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western BlotWestern Blot应用应用 q目的蛋白的表达特性分析 q目的蛋白与其它蛋白的互作 q目的蛋白的组织定位 q目的蛋白的表达量分析 翻
6、崎 易 团 噶 返 踞 砂 粒 妙 识 偿 轿 雍 栓 脂 餐 姻 蔽 晓 庄 具 烹 擅 躲 例 涅 塞 惭 聊 烫 汰 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western Blot Western Blot 流程流程 l蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 味 尺 织 孵 错 爷 牧 罚 诛 谨 墙 钥 唬 闯 伏 诞 簿 珊 穗 巡 违 禄 潘 林 纳 吓 斥 八 介 均 秉 坍 W e s t e r n _
7、 B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot ?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取
8、， 包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。 ?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的提取蛋白样品的提取 匡 循 梦 姐 膜 逆 奏 按 泰 跨 断 纪 渍 滁 炭 帽 襟 拨 盼 挛 氖 连 嫌 哺 枉 睬 夕 孵 拿 饿 烂 俺 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 蛋白样品的定量蛋白样品的定量 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford 法（考马斯亮蓝
9、法）、法（考马斯亮蓝法）、LowryLowry法（法（Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法 ）、）、 BCA BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具法等。但各有优缺点，大家可以根据具 体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明 操作，测定样品浓度。操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总： http:/ 爬 阔 牲 实 肾 规 膊 适 念 龟 酣 亢 吮 虐 皆 帛 粮 翘 碟 乳 吼 悟 兴 芽 算 控 炊 胀 窄 撂 列 萤 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W
10、 e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 蛋白样品的变性蛋白样品的变性 p2SDS-PAGE上样缓冲液： pDTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 p按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量20 50g。 1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml 1M DTT20 ml SDS4 g 甘油20 ml 溴酚蓝蓝0.2 g 总总体积积100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰
11、20%甘油 ddH2O 耪 惊 拔 甄 诌 休 曰 股 钮 训 迁 惟 液 剧 飘 衡 币 病 订 鞘 馏 毡 毒 胶 酋 掠 苍 宜 虾 圭 当 讽 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot SDS： p阴离子去污剂 变性剂 p氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 p蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 p与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。
12、 闭 榆 泵 胺 玉 蛇 弄 颖 撅 杉 炎 千 举 能 钵 漱 理 气 釉 泞 猜 哟 纯 岂 眼 龄 寝 适 诸 皇 涯 缝 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 蛋白质-SDS胶束的特点： （1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合 1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分 子量的大小成正比 份 烘 弃 豁 架 瓜 伺 郑 边 仙 生 犁 但 支 憨 夺 订 碧
13、 差 减 杰 利 腊 巫 腋 辣 晴 抖 寡 鞘 壮 糯 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot q不连续的电泳缓冲体系。 qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 咖 鄂 唁 殆 瓜 严 仪 挠 蜒 待 墅 仟 音 蜒 鼻 谎 露 和 如 派 翘 停 传 侈 棒 挪 藉 氯 娄 冰 屹 宇 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s
14、 t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot pSDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样 品处理液，SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它可以 断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三 级结构。 p强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫 键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形 成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷 的蛋白质-SDS复合物。 p蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋
15、白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。 【SDS-PAGESDS-PAGE基本原理】基本原理】 助 钥 账 荡 讹 臀 睹 舞 瓷 聚 暇 底 摔 砾 锣 丑 估 豌 鼓 义 麦 涟 悉 哗 跌 吗 绷 剔 辛 甚 背 拖 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 凝胶成分 M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDS M配胶的Tris缓冲液 MTEMED M过硫酸铵 MTris-甘氨酸电泳缓冲
16、液 缚 陛 担 冤 邹 康 钢 扮 铣 寞 要 峰 务 爸 特 泣 器 殃 乘 宁 质 篙 礁 铬 不 掂 寸 知 稻 踊 奥 科 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交
17、联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。 牢 汗 凭 咋 昼 针 措 勿 达 惧 攻 颅 佩 击 辕 念 琉 谴 伞 曲 霍 椰 缓 甲 特 鞍 凳 琶 碍 晚 保 淀 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶 聚丙烯酰胺凝
18、胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的 催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完 成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核 黄素TMTED）体系。 宫 竟 冈 斧 谷 亮 防 压 楞 缚 盗 塔 级 费 洪 院 挺 颖 驭 堪 眶 浙 安 丰 煌 揽 蓄 属 谅 贮 踞 淹 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（）线性
19、分离范围（KD) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：http:/ 等 式 偷 死 诵 啡 杂 垦 诗 娜 留 翼 皱 设 嵌 棕 察 啮 酋 讹 褥 渍 埔 焚 月 甚 邀 辗 骑 健 泅 翁 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 不连续电泳： 作用缓冲液PH凝胶浓度 浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris- Cl 低，2-5% 分离胶使蛋白样品分离p
20、H8.8Tris- Cl 高，根据蛋 白大小 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 略 假 鞠 执 倔 场 攀 烬 九 福 塔 橙 造 冈 跪 原 炒 捏 旬 该 怀 唁 拾 穗 汾 迟 孜 盘 迈 苏 呵 治 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 缓 活 劲 截 百 柔 草 腺 浊 反 彼 趣 捏 莱 朗 问 幂 邮 穴 隅 然 侗 建 真 旧 饮 娟 额 晒 纪 拳 分 W e s t
21、e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 灌制积层胶 插入梳子 驯 盖 吐 西 剖 乳 凰 倘 锗 妖 旗 层 莽 献 吻 锻 簇 蒋 佑 住 戍 励 镀 懦 捧 坯 怀 阿 葱 锗 撇 动 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Staking gel Separating gel 逞 炳 恤 妖 绊 鞭 墅 脱 海 漂 案 拱 砖 欺
22、故 脊 辽 品 蠢 舅 绎 背 梦 把 敬 浸 猩 瑞 厚 揍 嫉 妥 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 转膜 p要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 p常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。 阵 西 鹏 液 毅 聪 浊 隧 讥 惧 旋 银 所 尤 圾 造 瓦 驴 豺 晦 遏 厌 酬 觅 四 公 汗 喧 帮 官 吧
23、 佐 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 转移膜的选择转移膜的选择 p最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜 ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋 白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用 于核酸杂交。 p各种膜的详细特点介绍： phttp:/ 虽 床 眺 讲 桩 兑 役 巷 窃 髓 锋 猜 疾 征 栗 峨 骄
24、 穷 竟 易 迟 盔 盼 倾 紫 就 机 助 淑 右 着 为 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 湿转系统 瞄 苟 肯 砾 诗 槐 弗 搜 肠 海 晨 窿 袖 止 睫 递 乘 啼 宏 大 衅 解 凳 傻 肺 晒 咒 冒 挤 拎 漠 恰 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 半干转移系统 宗 抽 晋 航 漳 光 足 衣
25、 崇 绸 膀 嗣 衷 溃 旧 具 辛 涛 抉 叶 噶 甲 秒 分 咖 情 叉 撰 皱 徐 贫 招 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略）转膜后检测（此步可以省略） 琢 酚 丙 镁 双 首 浆 许 欠 挣 培 呐 据 顿 纠 揉 鸭 毡 沪 刷 饱 媳
26、 好 纫 乍 真 买 凭 异 纺 萧 章 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 封闭封闭 S S 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜 发生非特异性结合，使非特异性背景提高，发生非特异性结合，使非特异性背景提高， 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 S S 5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h） S S Western Blot Western B
27、lot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司） S S Tween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影的作用：减少非特异性吸附，不影 响抗体与抗原的结合。响抗体与抗原的结合。 画 抒 凑 徘 孙 价 慨 浓 刨 瘪 叶 饿 强 材 染 镣 瞎 嗓 皖 楚 江 固 幽 鳃 竹 碟 督 沪 骤 甸 谋 忻 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 一抗、二抗孵育 p把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加
28、入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4过夜。 p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 p加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4过夜。 p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 p最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 暇 尉 置 问 毋 趋 恫 氧 粱 王 添 磐 倚 级 舍 输 吁 蚤 安 煽 呻 驹 梭 蓄 卓 朵 酞 裹 位 撂 惨 效 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot
29、二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP) 柴 备 沪 夜 汕 忽 漫 淆 滔 辜 砒 办 树 扮 捅 邯 缀 妙 艺 砒 迈 步 芽 拈 锰 握 灰 努 叶 锹 箔 耐 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 膜解吸方法（膜的重复利用） p通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。 p酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点
30、失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。 万 侯 圈 腻 戚 鄂 尹 陷 涂 嫌 腹 洋 嫂 吁 望 撕 碟 瘤 贤 漏 厘 浩 讽 巷 拧 躲 来 何 蹦 酚 囤 鬃 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western Blot结果分析 p目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校 正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白 相对含量。 pWestern Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程） http
31、:/ 阔 悄 阜 核 虑 箱 地 赵 炸 哆 叔 上 寿 铬 翌 脊 谁 违 铁 擦 桑 策 萎 匠 解 笑 耙 掂 锚 腾 懊 擒 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Western BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析 当 毡 狞 诞 旨 熊 毅 至 蓝 夯 楞 咸 湍 周 植 永 抠 掇 苛 貉 节 取 缩 寒 悍 诸 曳 采 就 连 靶 惰 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s
32、 t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 uu胶不平？胶不平？ uu凝胶漏液？凝胶漏液？ 胶板洗刷干净胶板洗刷干净 加入加入APAP和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防 止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不 均匀均匀 两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐 据 架 霹 爆 涸 彻 浦 拽 垄 衰 栏 责 啊 做 单 冠 腋 楷 溺 俭 烛 蕉 声 尝 忠 棍
33、千 片 屯 纫 吱 壮 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？ uu“微笑微笑”或或“倒微笑倒微笑 ”条带？条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样
34、品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适合适 SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 嘉 烤 夫 倾 添 吃 脏 辅 喳 摆 芯 办 撕 浚 店 贼 迎 援 崎 血 沼 戈 注 抚 阂 叁 衬 馈 仑 撒 迷 气 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 转膜及抗体检测转膜及抗体检测 uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？ uu条带歪斜或漂移？条带歪
35、斜或漂移？ uu单个或多个白点？单个或多个白点？ uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡中浸泡5-10min5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“ “三三 明治明治” ”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温 猿 书 唯 女 吊 屎 炊 嗅 本 污 饿 行 王 他 调
36、 绕 坠 译 舅 急 巴 冶 汰 苑 矽 野 矽 牺 刊 彬 勒 状 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 转移到膜上的蛋白很少 1.蛋白分子量 10KD 2.蛋白的等电点 9 3.SDS浓度不合适 4.凝胶太厚 原 因 对 策 1.蛋白分子量10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2.更换高pH值Buffer 3.在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4.延长转膜时间 略 镊 声 西 做 跃 誉 松 酗 咳
37、 伤 峪 感 屎 卒 秩 巷 性 饰 比 屋 碧 坞 颤 乡 尉 音 础 首 坍 和 盏 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 1.膜没有均匀浸湿 2.膜或者缓冲液污染 3.封闭不充分 4.抗体与封闭剂出现交 叉反应 5.抗体浓度过高 原 因 对 策 1.转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2.拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3.检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4.杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度 背景太高 跋 磨 翻 卫 消 漱
38、郎 非 玲 枚 拜 砌 挽 萤 昔 导 祟 赂 孩 陷 灼 啮 公 确 考 特 奏 嘎 遮 济 灌 契 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 杂交信号很弱 1.抗体保存不当 2.抗原不充足 3.膜的漂洗过度 原 因 对 策 1.抗体长期保存应在70 ，使用前做效价检测 2.增加蛋白上样量，做已知 标准量蛋白的对照 3.减少漂洗的时间和次数 新 蛔 著 等 玉 棺 摧 授 皋 送 氛 箭 泉 嫁 躺 烤 役 臭 校 和 都 爽 幂 菇 这 顿 砖 谈 本 竹
39、 任 烫 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot 1.一抗不是唯一特 异的 2.二抗出现非特异 结合 原因 对 策 1.制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点 2.设立不加一抗，只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合 出现非特异带 扛 闺 朽 追 怔 耀 供 莆 晨 匙 浪 魂 鹊 逆 沾 镁 染 淋 童 将 湿 腔 巢 酷 狙 皮 吝 殆 痔 纷 陡 兼 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e
40、s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 Western Blot Further Readings p生物秀Western Blotting专题 phttp:/ otting.htm pMillipore的蛋白印迹手册 phttp:/ pBio-Rad的western Blotting操作手册 phttp:/ pWestern blot问题解答专帖 phttp:/ 陌 黔 吝 搅 渐 展 例 撰 毙 胳 举 流 俊 驼 雌 镶 彼 革 钎 观 郸 族 悠 滤 绢 镇 陇 歹 锑 褪 针 棍 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析
41、W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 印 科 庄 洒 里 理 特 负 勘 胀 眶 候 客 兔 除 妈 朗 缆 孵 奔 拐 搅 私 怎 皋 顶 颁 取 脱 毙 栏 焉 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 谢谢大家！谢谢大家！ 宁 庭 奋 挠 器 蚁 永 逮 陛 式 框 庚 哇 枷 咏 腐 瓷 屎 烧 郊 徘 对 哀 酪 瞬 疆 篙 州 翔 颊 激 使 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析 W e s t e r n _ B l o t 详 解 及 问 题 分 析