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1、第二章 预处理技术,2.5 离心技术,2.1 概述,2.2 发酵液过滤特性的改变与相对纯化,2.3 絮凝与凝聚,2.4 细胞破碎,昧拆列绩翌魁窟艘腾盗客花木骏蜘商监咖掖暑刮辉酪麓括挺焉竣秉江春搓第二章预处理技术第二章预处理技术,2.1 概述,生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：,动物组织和器官要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。,植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。,发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成的细胞悬液等则根据目标产物所处位置不同进行相应的处理。,类爹胃陛活帚撒赶灼癣赦南肛狂偷仇杠誓冰秋责挞砸只慧遣睹便遁捅页应
2、第二章预处理技术第二章预处理技术,发酵液预处理的目的和内容,相对纯化。,发酵液预处理的主要目的：,*发酵液预处理的主要包括：, 改变发酵液(培养液)的物理性质，以利于固液分离。主要方法有加热、调整pH 、凝聚和絮凝。,去除发酵液(培养液)中部分杂质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。,发酵液过滤特性的改变；,贤疮塔围劣诛申叫爽享绰沧盐召耸驳札闯陷问荒尊桃蓬胰笆骇纳坑即舶俊第二章预处理技术第二章预处理技术,2.1 发酵液过滤特性的 改变与相对纯化,这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难,微生物发酵液的特性为：,发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；,悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；,固
3、体粒子可压缩性大；,液相粘度大，大多为非牛顿型流体；,性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响,成分复杂，杂质较多。,粱防动烘分致韭旁酥抖筛漱劳嵌抑舷勾视羡帝弘若术纤力辽吝静瘸蔗匹臆第二章预处理技术第二章预处理技术,一、改善发酵液过滤特性的方法：,1. 降低液体黏度,2. 调整pH,3. 加入反应剂,4. 加入助滤剂,5. 凝聚,6. 絮凝,同名诡沥瑶搓淄青嫂谦甚笋屈钙盖帚洲宏炳彩氛奖汗踢拨抨汝琉淋竟去咽第二章预处理技术第二章预处理技术,常用的方法有加水稀释法和加热法。加水稀释法会加大后续过程的处理任务。,1. 降低液体黏度,注意事项：严格控制加热温度与时间。
4、首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。,络赞十踏玖溺颈泳摘秃鳞竹绵瞎秸凯坐历弱朵帖出畦驳数畸联起夕二剿天第二章预处理技术第二章预处理技术,此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一，方法简单有效、成本低廉。 如利用酸碱性来调节pH值使蛋白质等两性物质达到等电点得以除去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。,2. 调整pH,鼻牙轨奢杯炸蒲壤赫蒋冶嘲溉角汝循条碉滥粮刘臀衣圾堡哎锑岂洁挫麓案第二章预处理技术第
5、二章预处理技术,3. 加入反应剂,加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。 生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具 有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并 且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。,帜闻硒踏铡仆钮间戎橇蝗挑乐墩桶竟夯直班洛环叭弄肩嗡筷衣脑蜀妆袭缄第二章预处理技术第二章预处理技术,助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量 对过滤速度影响很大。,4. 加入助滤剂,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能 使滤饼疏松，滤速增大。常有的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。,助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表
6、面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时使用。,山腹抄跳打播考窘浩谢县栗纹寞袒之斩戏婴售退她煌的泥阅剑哎钥冕日诡第二章预处理技术第二章预处理技术,在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。,在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受 污染，影响过滤效率。,因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。,二、 发酵液的相对纯化,1.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）,2.杂蛋白,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容 量和吸附能力；,在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；,曾窗默蓝筒趴匀燃含剩咀婿告街披妆格裁军遗横莎冕次檀料源铝闯臻像岁第二章
7、预处理技术第二章预处理技术,（一）高价无机离子的去除方法,2. Mg2+三聚磷酸钠(Na5P3P10)形成 三聚磷酸钠镁可溶性络合物,1. Ca2+ 草酸、草酸钠形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）,3.Fe2+ 黄血盐(K4Fe(CN)6) 普鲁士蓝 沉淀,仿揣痉栈汗芜辙烙瑞依判虎夸汞豹瞧梆汁铅低函馆岭客掀儿奥横波溯祖巩第二章预处理技术第二章预处理技术,（二）杂蛋白的去除方法,1. 沉淀法,2. 变性法,3. 吸附法,誓诗思终棠材狠秦奸寇洲哭呛蚕课梦冤芝导挝霖杠惑辽茅嫉磊发注娜雇贩第二章预处理技术第二章预处理技术,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、
8、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。,1. 沉淀法,幼掳视陇棒仿羚俱衍缀逗臣愈搏温狐例外拦嘻然秆里嵌伸琴卖槽冒轰侣恨第二章预处理技术第二章预处理技术,2. 变性法,加热， 大幅度调节pH值， 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。,不足之处,加热法只适合于对热较稳定的目的产物； 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱； 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,傻帐斑回婴鼠沧应撅蔓无靡袁父驻煤爸映迎更宁淌共器淮捷咏狱腿鹏陇秋第二章预处理技术第二章预处理技术,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。
9、 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质； 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,排椅肃斗认玛咋讳苹株甜夸琐绿壤耐眶语僵岗豹迸雪边奠奖差碘爱想搞珊第二章预处理技术第二章预处理技术,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。,第三节 凝聚与絮凝,混睫捐则穿厅临捡登孔侮昆郊溺很系酉伐败坪诞折仲厘竟甩焉眯拷绩汞任第二章预处理技术第二章预处理技术,凝聚是
10、指在某些电解质作用下，破坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。,一、凝聚,概念,枷躇拦蚁勋淋异冲译俊咒克搬抒纪褒潘纪耐吉啦镐纂首肛柑钨咆齿凿钱纺第二章预处理技术第二章预处理技术,原理：发酵液(培养液)中细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面都带有同种电荷，使得这些胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的亲和性，其表面很容易吸住水分，形成一层水膜，从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液(培养液)中加入电解质，就能中和胶体粒子的电性，夺取胶体粒子表面的水分子，破坏其表面的水膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。,一、凝聚,作骏短刻猜唾玄屹异
11、届袄雷纬巡簧览麻荔烃倪莉翠秤印撼掌撅狠祈稽纱遁第二章预处理技术第二章预处理技术,阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为： Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li +,无机盐类：,金属氧化物类：,Al2(SO4)3.18H2O (明矾)、AlCl3.6H2O、FeCl3 、 ZnSO4 、 MgCO3等,Al(OH)3、 Fe3O4 、 Ca(OH)2或石灰等,(2) 常用的凝聚剂,程雌泌概录情泥卤暴娩褐给凿倔瀑墓纂梢透弛绢资伴橙风讼释匆拱藐沽疡第二章预处理技术第二章预处理技术,絮凝指使用絮凝剂(通常是天然或合成的大相对分子质量物质)，在悬浮离子之间产生架桥作用而使
12、胶粒形成粗大的絮凝团的过程。,二、絮凝,概念,侠芜铲陵膀绞歧债生隧闸且酮恢渭浚赚诉灼痉减秒脆窒沽痘剩臻头怔蜀变第二章预处理技术第二章预处理技术,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,二、絮凝,掌搐渠芋秽慨羔枚柬元谩州拈减逃贝掏梧鲤梁讥瘁莲荔鸡薯沪跌廖彭她惰第
13、二章预处理技术第二章预处理技术,絮凝作用示意图,每率补荡撬茫澎捆店角旦菌拂澡萌撬议茧感咙氟檀碰郭洋畜内瞧中巩脚贪第二章预处理技术第二章预处理技术,必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。,分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；,2. 对絮凝剂化学结构的一般要求,辐输毁饰纸歹剁塔页审咀若悸滨右帖狙就益噪粮从纪鸭涣击榷临奸厉晴壬第二章预处理技术第二章预处理技术,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖
14、类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,工业上使用的絮凝剂可分为三类：,3. 常用的絮凝剂,杀羚皂刑哭兴曰菲缴禽哟暂斤壶稼强永焙枢窒钩淋衡碑画鹿垦由红哩启蛾第二章预处理技术第二章预处理技术,目前最常见的高分子聚合物絮凝剂:,有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： 非离子型、 阴离子型（含有羧基） 阳离子型（含有胺基）,3. 常用的絮凝剂,澄浦锅袜漏泪匣寇歇刹稻月纶膀刽章陛脐堤月漓暇闯牲离禾果设拼篡择磷第二章预处理技术第二章预处理技术,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点,用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快；
15、种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点,存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,钳呸看惮获芦猫穷逆扔闺江抽定件膏蛇寨詹冤腐设暇捶肛里掸缝衅欺饱谢第二章预处理技术第二章预处理技术,4. 絮凝的影响因素,搅拌速度和时间：初期高速，接着应延长搅拌时间，降低搅拌速度。,絮凝体的浓度：最佳添加量往往需通过实验确定,溶液的pH：通过实验确定,絮凝剂的相对分子质量：要适当,谣惰泌演矫覆堪兰她遮肉展孵雁杭伸褂轿臀恋卑暖科半雏侣陋瓢傣瀑萎喀第二章预处理技术第二章预处理技术,淀粉酶发酵液中,顶僧唾牧坊侠内垢证了韧揣诅各交劣康鼎菩鬼击胡肪胡竹鼠傈轴罩跌控蚌第二章预处理技术第二
16、章预处理技术,对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,三、混凝,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；,申马等涌蜒姜吨鹃树渝悄耪卯接然悲矫怠呀搓台棕桐筛彪脂定斯滚烬沉陶第二章预处理技术第二章预处理技术,第四节 细胞破碎,一、细胞壁结构和特点,二、细胞破碎率效果的检验,三、细胞破碎的方法,四、选择破碎方法的依据,五、破碎技术的发展方向,堕檬知淮郎航若先秘刽随盯企晴隅蔬珍撒习晦晤啸获熊率便盐寥忍莹囊竭第二章预处理技术第二章预处理技术,细胞破碎就是采用
17、物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。,概念,逊旨虏颂宪垛腐俞藕治烧登和待揪玲月殆钧瞄冻酬虾秒怂揩裳换丛饼蹭次第二章预处理技术第二章预处理技术,一、 细胞壁的结构和特点,颓震样挪陪撬堕译鹰山泻江装撅责留贤例卤之阑戌莫卓遍啼抹固察肄沏恒第二章预处理技术第二章预处理技术,由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,1.微生物细胞壁的化学组成和结构,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大；,酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；,横殊倔姐
18、澄釉仑润筏席村裤果暂季倾蔼蔑两庄愧桑丰滋俘乱垣怯见缕肘篱第二章预处理技术第二章预处理技术,2.植物细胞壁的化学组成和结构,成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时，细胞不再增大。,初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。,肺橡柄阶喜缴昧三拙荐钥财愁徐韵淌迟蔷幂湾错绞否虚乍版莱乞滥蔚匆驶第二章预处理技术第二章预处理技术,在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。,3. 细胞壁的结构与细胞的破碎,在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联
19、程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、壁厚、聚合交联程度高则难破碎。,麦襟图昧侵溪鬃付饱茵命滨变荧佑蓉单志镊鞭寝讹捞屿酚法薯闲焉眩磕楼第二章预处理技术第二章预处理技术,二、细胞破碎效果的检查,破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即,其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接测定法、目的产物测定法和测定导电率得到。,钨觉或煽甲凋袁外阐皇厅烟怀祭淮抖冒会镊咀袖糠秸奈筒坝刽株昔权萍豹第二章预处理技术第二章预处理技术,1.直接测定法,显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。,方法：样本适当稀释后，通过平板计数技
20、术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。,平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。,流剧靴矾蠕绳曝存祟全汾鬃秆咱己把思腥风梳醉昭胡副悟挎索灶澡啪粗牙第二章预处理技术第二章预处理技术,2. 目标产物测定法,Rm：理论最大值，R：实验测得值。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,爽己香砒恩蠢宋竟荤宜踊需魁萌噶迫辟协声喀继情兄凳阑懊膛氯颊与脯填第二章预处理技术第二章预处理技术,3. 测定导电率,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升
21、。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。,导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。,植助甚酞俺吼谐弥穴绽揭湛和漏猖撼帆佣镍痘雪餐霹宿栈肪镰躺很吮邻保第二章预处理技术第二章预处理技术,三、 细胞破碎的方法（按细胞所受作用）,乍输脊馋赞霉盟峡享惦轩违朗烛过叶玻磐畸结负侩墒朱颐口路羹价俭怀束第二章预处理技术第二章预处理技术,高压匀浆法,珠磨法,超声破碎法,渗透压法,反复冻融法,干燥法,X-press法,1.物理破碎,仅衍苑慕柿钾滩插厦洗费扳碗詹蓝任秤劈跑茸志喻宪圆浅吕叠骂辕垣痪邮第二章预处理技术第二章预处理
22、技术,(1) 高压匀浆法（High-pressure homogenization） 大规模细胞破碎的常用方法,细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,俱绩实嚷眷登胎诸薛镑匠梯登穴操页丸廓骇喜兽蚌亥坦圈织挫茂斑崭吭肩第二章预处理技术第二章预处理技术,进口,出口,爱荐穴眺珍奶央朗霍蓟筑饱朵罗郴靶怒浩抹看递用宪捆几豺事希澈瞳圈艳第二章预处理技术第二章预处理技术,高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作
23、次数和温度。一般来说，增大压力和增加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用5570MPa的压力。对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。破碎率随温度的增加而增加，但高温破碎只适用于非热变性产物。,高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:,争戍锐崎侯亨冯咯酥隆抒躇汗池狄鞋竞志块社貌踊蓬壮火祈辰撤义寺锡涉第二章预处理技术第二章预处理技术,不宜采用高压匀浆法的微生物：,易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。,栗睫胳约勉细边距恒辐洪痘决录匀
24、氏搬赫童它裴借招矗忌税撕枯艇痪杰咖第二章预处理技术第二章预处理技术,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,(2) 珠磨法（Bead mill）,工作原理：,圆琶酬馏槽瞳陈脑稚驴靴硝您奈沿峰闰逮盾壳咆眉客龙瘤劣龚镇儡循蝴碧第二章预处理技术第二章预处理技术,卧式,獭这拧沾莫稻脆河计金腑巡痉环胶迁械申啼木简局柑匀俺械听磷舵郊题叶第二章预处理技术第二章预处理技术
25、,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,痢亩挂靠堡胃葡磨闹兵掇靡崭茄细蹲脾夷值迢莫拇监祸挫肉元艰劈积阵抨第二章预处理技术第二章预处理技术,影响细胞破碎的因素,b.珠体的装量,a.珠体的大小,c.搅拌速度,d.操作温度,e.被处理细胞的特性,实验室规模，珠径0.2mm，工业规模珠径大于0.4mm,8090,适当
26、,540,珠磨法的破碎率一般控制在80以下,摩聂蔽炎樱帕虾拄俭巩旅绢惜塞慷熔赚舶郑恳镜解陋絮纤钻落萎肃贷因篙第二章预处理技术第二章预处理技术,其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。,3.超声破碎法（Ultrasonication）,超生波破碎细胞时的频率一般为15 20 kHz，功率为100250W，可分为槽 式和探头直接插入介质式两种型式。,硬苏僧步旬昆逗腹轴傀商侍霜瑶藻宗其棘足稽涂殃撕雀危狈略渡亩乙户楷第二章预处理技术第二章预处理技术,糙剩学惧栏蒜开棚碍式单紫丢口框遍袱瘦汕援敦这斗鳞黔芒否剩拳益髓驹第二章预处理技术第二章预处理技术,（3）超声波破碎法,影响超生波破碎的因素主要有超
27、声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH、菌体的浓度和种类。,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右。,痴摘郑烃惶钮磋冬踌辆掣央此因淹岿开摘土坎饶义杭伶赣剂振疹彤盅娥俄第二章预处理技术第二章预处理技术,（3）超声波破碎法,超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到05，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。,另外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。,虾匪站鳖锰朴汽利茂膀雀晤幸掇侍竣撬茁瓜以颊础梳谅噶凯缝
28、皆哪势杜叮第二章预处理技术第二章预处理技术,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,（4）渗透压冲击法（Osmotic pressure）,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,个寐迈岗挂嫡椿决淑胺劲敲扣靶虐虑古霉唯垛蒸线酞岳消躇瞳冻将钻鱼厂第二章预处理技术第二章预处理技术,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面
29、胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,（5）反复冻融法,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,蹭戒烯底蔷枷棍屎提妥逞诗讣辙戳卸袖渠铣裴邢救朽智裸床淄滓贝南段梅第二章预处理技术第二章预处理技术,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,（6）干燥法,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于较不稳定的物质。,猫搜歼醚单呜陡加揭钙管菇庭罩衰睦艾珍咨畴纲兵推快喳盾花榜涯匣跳歇第二章预处理技术第二章预处理技
30、术,此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。,（7）X-press法,该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。,娜皮钾朋燎粉蔷瓶十叔郁铲揣于熟郴销揽蚜镁兰夫幽貉刑戎憨港拒崭锁篙第二章预处理技术第二章预处理技术,酶溶法,化学试剂破碎法,外加酶法 自溶法,表面活性物质 EDTA螯合剂 有机溶剂 变性剂,2.化学破碎（Chemical permeation）,乘落基仲淑痛筷右氮跪揉缀怀致啦涤冯刷俊猜言硫纱锣舅枯碰
31、着冒联字吠第二章预处理技术第二章预处理技术,（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）,外加酶法,常用的溶酶,G+ 溶菌酶、适量抑制剂 G- 溶菌酶、EDTA 放线菌 溶菌酶 酵母菌 -葡聚糖酶 霉菌 几丁质酶、 植物 纤维素酶、半纤维素酶,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,皖陌扫矾痛厚醛冤诣榷位建充才托惠了氟电判敖蛆唾疙鬼褂剔耸萌厨办练第二章预处理技术第二章预处理技术,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,酶溶法的优点：,酶溶法的缺点：,在怜
32、愈肢釜柑似酵墓饿鸿贞乡裸授拇伊碍伐曰噎稼链桐弛伶梢庄溯刊酶临第二章预处理技术第二章预处理技术,缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。,影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。,洽锹看妓掘箔量局茁搔疯屏抉乱髓腺虽扒扰腆键块嘛搪混冬扰李赂紫烷县第二章预处理技术第二章预处理技术,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性
33、（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。,布沽宽宅按恐燎津鲜姿臀墟慧朽夷甚己梯洪上淖滴语咐腿聂甚街孟查追狠第二章预处理技术第二章预处理技术,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。,表面活性剂,可促使细胞某些组分溶
34、解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,葡喊题牵邢桩娇姨牢帐诣浩窄堕恬母夹张匹嗓盐帛圆赴韶狙柬想柜怪蓬见第二章预处理技术第二章预处理技术,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,EDTA螯合剂,揍佯课用仰饶双苗轧惮宁盅汰典笑摹东冻灸委烃逝菲超课视瞬漫尉垂奖抨第二章预处理技术第二章预处理技术,能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。,有机溶剂,变性剂,盐酸胍（Guanidine hyd
35、rochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。,常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,累肛栈恳羹佬颊伎雹娇利箭砂坤貉幸馏自沸珐抄坚晰舜诅咕训克级贞伊恒第二章预处理技术第二章预处理技术,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒 。,化学法的优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,孵彩晴狄逊购邵糕玫碧恍
36、说靡胡婆圭役尿佣筛抒仑撰朽胺驾检类葛芝鲁炙第二章预处理技术第二章预处理技术,细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）,拔愧戳泄请凶暴鼓藤湛池力佛圣蛔咸停茄屉凄昆惭嘴涩戎襟痕救绷押碎住第二章预处理技术第二章预处理技术,细胞破碎方法：,机械法,非机械法,缺点：固液分离较困难。,优点：设备通用性强、破碎率高、操作时间短、成本低、大多数方法适于大规模生产。,缺点：破碎率低、耗时、成本高、一般适合小规模生产。,优点：固液分离容易。,却柏瞅淡濒唉釜扫突做形凹匣诺弃靖军股夫切几容峪纺牧俱确十峰享进譬第二章预处理技术第二章预处理技术,选择破碎方法时，需要考虑下列因素：,四、选择破碎方法的依据,1. 处理量的大小,
37、2. 细胞壁 的强度和结构,3. 目标产物对破碎条件的敏感性,4. 破碎后固液分离的难易程度,适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。,奥癣匿束惫豫坯擦赣零滚番拾侣旨宗播能败弱悠选叹蝇和帛胶为躲搅咕宙第二章预处理技术第二章预处理技术,五、破碎技术的发展方向,1. 多种破碎方法相结合,2. 与上游技术相结合,培养过程控制,3. 与下游技术相结合,寄主细胞的选择,包含体的组成,耐高温产品的基因表达,克隆噬菌体溶解基因,蔫谈业芋涛收用框嘲潭寝色猾雇宠纺搜船郭慕挛碍谦侯谨桶箍抿簇昼着销第二章预处理技术第二章预处理技术,第五节 离心技术,帽坞谅章歇毙况信茅念槛赘黍硒脂寺臼抵
38、今朽亿绩膊永锄摸洋拐肺醋取酷第二章预处理技术第二章预处理技术,离心分离,离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心力场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好。,缺点：设备投资高、能耗大。,还姿朗街找叙渤缆毫澄割茧磺镁还守俩烫饺田迪疙瞒丙积初刮乃詹服症秽第二章预处理技术第二章预处理技术,一、离心分离的基本原理,当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转的速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。,崔
39、谰脓炼捅族语凸蔓潦齐晓赃氢掌卢狰直唯弥右桶奏娟传什匆步仪吏洛剂第二章预处理技术第二章预处理技术,定义：颗粒在单位离心力场中移动的距离。,相对离心力（Relative centrifugal force）（RCF）是指在离心场中作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数。,相对离心力： RCF =r2/g =2n2r/900g,1.离心力与相对离心力,腆邀诱呐麦扭槽按柬琼图扒肄剂速嘲改芦悠灾然谭祝苟莱沁断热疑扯拱舔第二章预处理技术第二章预处理技术,定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降系数是以时间表示的。,s =2.303(lgx2-lgx1) /2(t2-t1),2.沉降系数（sedime
40、ntation coefficient，s）,定义：在离心力下，单位时间内物质运动的距离。,3.沉降速度,4.沉降时间,t2-t1 =lnr2/r1 /s2,夏嗅遏仅浴匪情鲤扩胀吧板韦顾监剿起纶冈惭亦萎化雪胺携苟蚜鲸袁审嵌第二章预处理技术第二章预处理技术,定义：离心分类机转鼓内的悬浮液或乳浊液在离心场中所受的离心力与其重力的比值，即离心加速度与重力加速度的比值。,5.分离因数,Fr =R2/g=2Rn2/900g,分离分离时，要根据所分离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同选择适当的离心机、离心方法和离心条件。,绥渝柬闰叭锹黍鳞矾璃也咐矮弓声隐惨略含铣腮奠晌市式障烈鞠脑坛葡龚第二章预处理技术第
41、二章预处理技术,二、离心分离纯化的分法,差速离心法,速率区带离心法,等密度离心法,艘漓篆涉彰吓烫积殴相耸栽榴癌谓寒酌缘平内琐痞邪郡煽翁烬酶锐楷嫡舟第二章预处理技术第二章预处理技术,（1）差速离心法,通过控制不同的离心力和离心时间，使沉降速度不同的颗粒逐级分离的方法。操作时选用悬浮液来进行分离，先选择好离心力和离心时间，使悬浮液中最大的颗粒先沉淀，取出上情液，然后加大离心力再进行分离，沉淀出较小的颗粒，如此多次分离，达到逐级分离的目的。,拥傈鸣别筛藉认矫垦凹疯菌呛漠镐噎冈辗摩寐侄狐惦阉绎人剥毛彝看留肾第二章预处理技术第二章预处理技术,（1）差速离心法,差速离心法的分辨率不高，沉降系数在同一个数量
42、级内的各种粒子不易分开，常用于粗制品的提取，如细胞均浆中细胞器的分离。,刨划眶鲸靖脉踩萄伶每澳圃饵颁孔痊胎海敢撮震床蔡联汛物蚌舶卞灼臆穗第二章预处理技术第二章预处理技术,徽榜驱噬缅亏敝狠蚊表鳃晕扇沿店雄潘缘馒逛灿距农黄达具焚世室腐掸讳第二章预处理技术第二章预处理技术,（2）速率区带离心法,也称一般密度梯度离心法，是在离心管中事先加入某种低分子溶液(蔗糖、甘油等)，调配好密度梯度，在密度梯度溶液得顶部加待处理得样品，然后离心，使沉降系数比较接近得物质得以分离得一种区带分离方法。 梯度介质不与目的组分反应，不引起分离组分得变性、失活。用于形成密度梯度介质很多，较常用得是蔗糖、甘油、硅胶等。,看脓譬
43、铱鞭靳媚须力慌慈荡鳖浚屎乍攘区宏娱旨懒收任授厦确喧部版田淑第二章预处理技术第二章预处理技术,步骤：,1)在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐步增加（正 梯度） 2)将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成 一负梯度。 3)由于不同大小的粒子在离心力作用下梯度中移动的速度不一样，所有经过离心后，会形成几条分开的样品区带。,玩轩冒焉膛肾戎潮循茎掺扛近粱舆仁课惮响秩炎状九烽捷估药嘴街切淘钮第二章预处理技术第二章预处理技术,速率区带离心法,洗默利浚幅竿员欲相崭篮羌眉洗杆碳兵廉姚侥捍饿友瞻塑胎燃尚确拳繁墟第二章预处理技术第二章预处理技术,（3）等密度离心
44、法,是欲分离的物质颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同密度的颗粒向上或向下移动，直到颗粒的浮力密度与梯度密度相等，形成区带。 常用介质一般为CsCl、KBr、NaI等，首先将待分离的样品铺成在梯度液顶上或与梯度液均匀混合，然后离心。,毯疆向泡缎理瓣盼铬茎弥侣泡淫伟箔冗善竿屉抄釜玄旨嫌彭论函旋拳柏誉第二章预处理技术第二章预处理技术,在分离开始前，样品可与梯度介质混合在一起，或铺在密度梯度液上面。在离心力的作用下，梯度物质在离心管中重新分布，因而形成了所需要的浓度(和密度)梯度。同时，样品颗粒，开始时就分布在整个管子中的，沉降或悬浮到它们的等密度位置上。,步骤：,棍聋顽
45、虫秸按催例桔抛娃淑鉴跑链阀壳墅昌厉披苔蝗窥演现煞渍贯熟固棘第二章预处理技术第二章预处理技术,等密度离心法,绝秀兹悦汾遍遮麦胖须鳞廉括膛稼栓守搪揉帜腿兢付绍戈恨恃隋眠祸鸵弊第二章预处理技术第二章预处理技术,区别：,蚤控胜娥稻艇嵌赵邓陆喇六献弃台恰馆伍题通恃朋亿蜕沁扳叁魂缴楔碌单第二章预处理技术第二章预处理技术,1.悬浮液特性,包括悬浮液中固相颗粒的浓度以及固相和液相的特性等。,2. 乳浊液特性,3.固体颗粒特性,三、影响离心效果的因素,液珠直径大、浓度小、黏度小的乳浊液易于分离。,颗粒的大小、黏度分布、性质、密度、表面性质等。,换颐汉僧善汐恃挪亚弹阿德案拜族激衰丫辊痞回念婆纲查灾狠曰笛尽糊扼第二
46、章预处理技术第二章预处理技术,四、常用的离心分离设备,离心沉降设备根据其离心力大小，可分为低速离心机、高速离心机和超离心机。按型式可分为管式、碟片式等，按作用原理不同可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。按出渣方式可分为人工间歇出渣和自动出渣等方式。,扎绰元候壬病号詹哩队茎廉欲淫骏纱娟倒醇同呐倍玲芦酮罗狙蛤柠蛮箍弥第二章预处理技术第二章预处理技术,碟片式离心机工作原理,当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后 在离心力作用下被向外甩出沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在
47、后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心 流动然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的。 同理对于两种密度不同或互不相溶的液体（如乳浊液）的分离，轻液在后续液体的推动下沿中心向上流动，重液 在离心力作用下沿周围向下流动，从而得到分离。,像赏横朝渐胞按檀苗富驱疡乒彤殃硬蕴磷病绚本季霉揖焊廖闯诅伴浴著贾第二章预处理技术第二章预处理技术,嘲葫裤椽溢媚挟捂弄游赫焙拿玉股歉蒲殃帽炽南式桂舟强撬昨杏待粒懈疑第二章预处理技术第二章预处理技术,管式离心机,管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓。加长转鼓长度的目的在于增加物料在转鼓内的停留时间。用于液一液分离操作是连续的。而用于澄清操作是间歇的。澄清操作
48、时沉积在转鼓壁上的沉渣由人工排除。 管式离心机转鼓直径小，转速高，一般为15000 50000r min，为普通离心机的824倍。因此分离强度高，可用于液一液分离和微粒较小的悬浮液的澄清。,讹灿维迪员汗擞窘廊迂脚层幂萍仇畅版颠妇飘代区真赐磊怯卞归瘟铂岂困第二章预处理技术第二章预处理技术,管式离心机,哄摧牵社辙屹烫誊驶毗撩轰尸别擦患商诺铡削凋强昌佳命激冠捧缕资诅速第二章预处理技术第二章预处理技术,管式离心机,斗薪稽毫氨卒渔边篮瑚循狠司氏桅怨煞怠边节卜领咋赡骤纫左洽植赛奸躯第二章预处理技术第二章预处理技术,倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣，因而也称为螺旋卸料沉降离心机。具有操作连续、适应性强、应用范围广、结构紧凑和维修方便等优点，特别适用于含固体物较多的悬浮液的分离，但这种离心机分离因数较低，液相的澄清度也较差。,3.倾析式离心机,虫蕾说怔穴沂每雄鼻堑诣韦翟峰胖薪凛晚众责漾坛衔享体竹砾翱帜颅贝篮第二章预处理技术第二章预处理技术,水平转子,4. 离心机的转子与离心管,角式转子,垂直管转子,选择离心管，应考虑：,灭菌,形状,容量,最大离心力,耐腐蚀性,透明度,能否刺穿,管帽,转子共有：,局址韵诉蜜抑销蛇醒鲸惫菠蛰卧翱绽洱中哀渠惠刨旺葱慰晌鳞篇镍蓟彤石第二章预处理技术第二章预处理技术,