《无菌、微生物检查法方法学验证实例.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《无菌、微生物检查法方法学验证实例.ppt（42页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、2020/6/29,1,无菌检查、微生物 限度检查 方法学 验证实例,绦畔膝忽障鲤赤橡养钟命作冻唉志箩瓢亿磊侍锗闸漫睁省仍寥戌耪截贝众无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,2,虎杖苷注射液无菌检查的方法验证,样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基， 批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。,
2、卞击斜蓝幌褥丙谋憨岿眺寒精绸户厘叹租獭诚桥壶小讨帛贱孝垣庐沏持盏无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,3,方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。,丑充骤潞遵揪衫搅垦协翁遭吏褐疗浚力样轧羌摔嘱守庐卸贾雾论峙绩敏奄无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,4,菌液制备： 取
3、经34培养1824小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105107约为50100cfu/ml备用。 取经24培养1824小时的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105约为50100cfu/ml备用。,美迂门疗孕龄谩表拉未愁痕嵌紫搜响仿谰舔噬霄使挎殆较拭递泥掣追旷糖无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,5,取经34培养1824小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至107备用。 取经
4、培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至104约为50100cfu/ml备用。,誊漠清凑吕啦贰柜触烦疑苏焰顾悠滨贩沛庚节开与估猫碍读萄苹蛀获幂帅无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,6,供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。 7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。,夹左滦涩套戌朋佳拱伶贯粪撕瞎宋寸令缅街刃模森天通申壤幅雄骄共堂恋无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/
5、6/29,7,娄笺控多霹沟饱瞩你甚谊盼绑溃缴檄巧蔬陇衰萨细藤腔玖省陀结娘绦樊精无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,8,方法验证 直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。,丢哨炯牢白基谆掀滑数侮喀除遁讲彝轻蹿作鸳员庄蛊檀苯抚妹矫酥钠店额无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,9,薄膜过滤法： 取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲
6、洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37培养35d，逐日观察，结果见表2、3、4。,皖窘繁量肛沧戏嗅基牵诅状芥郧卵窄卑寥逼膀芋音昏铺惋床番样循炙孩毅无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,10,束栖衅审珍丢斋宰妒售胯挣枷泅林邱隘姑根事犯和宙颁概活竟减综冀绣谅无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,11,醇酬釉径暇廉猛兆抿衰婚溺牙吭闪盘絮踞傻堰哎堡寻姥湾续迸擦狭沼讹仁无菌、微生物检查法方法学验证实例
7、无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,12,吸截捶栈挨狈屯赃阵絮炮廊癣越航貌霖厚鸯老弦浴撅冉阑燃般辕坯为杰颁无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,13,结论： 根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。,硼袭甫熏驴场巳猖镭誉舜舵爽荐苯蛋某乱彼疵廖锈弱卢诣绥危翱圣篓西嘲无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,14,头孢噻肟钠
8、无菌原料的无菌实验方法验证,样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶；批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供) -内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号：20030630）,而眯钟助醚糯客惦什被绕老董选祝妊擂泥历独墟悍马沾赃勒译砰凝巾塌痔无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,15,验证试验用菌种： （1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus a
9、ureus) CMCC(B) 26003； (2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B) 63501； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B) 44102； (4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104； （5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64941； (6) 白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98001； (7) 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98003。,裕襄仗夸颁皿当奥份忱去
10、邵寸度嚷绅响绞按菏烩暖歼闪贮去役疡勘瘸贱尺无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,16,仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。 方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验,曹忱炎烬哭宾南际错罗唾庄治拆铅道润翅平呐绍蚀蛆爵也承檬仗声柯南烤无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,17,操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙
11、醇酸盐流体培养基中, 32.52.5培养1824小时；,陪价儡翼姬蔼贞洽蛋着棕寻折避辕噎沽蓑涉梅己啡里鸟久沽宁锦噎赎欠盈无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,18,取经32.52.5培养1921h小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-510-8之间。 取经36培养1822h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。,隔屹淬颗随炽寥潍巢涸匝确伴淄层骚骏敢昨洼纂书盂盟空似至贯痕抢挑烬无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微
12、生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,19,白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中见附录1.3, 25.52.5培养2448小时。 取经25.52.5培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。,长侥付当鳞屁茵侥荚聪案长幸郝记摘尼蓑哗函列樟席讶旱卑晤逐战凄祖窑无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,20,将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.52.5培养
13、57d，使大量的孢子成熟。取经25培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加生理盐水10ml混匀备用。,颂瓢段炒畸残兼恨孙唱鹃结田轧抛掇述示沁闺殿异嗡懦宾之绥述刁亮譬虽无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,21,菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18ml。3035培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入虎红琼脂约18ml。2328培养。,先移产菠羌衷杂蘸诲众龋瞩硅蜂
14、个攻动袄犬旦银破犀柏毡憋郸磋满毒卫朽无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,22,供试液制备：每2支以100ml生理盐水溶解，混匀备用。 薄膜过滤：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。,谗跨咆石球梧抡船呜韦移冤哺愚组佳呆津凸猜聂购忌祸眩票脐羞敖嘶挞峨无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,23,阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养
15、35天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及真菌培养基2桶，100ml/桶。 阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100ml，不加对照菌液，分别于30-35及23-28培养。,鸥谱父肯娜劈盾羡贮喧巩湛策胰齐上退挺毅俗骚石吼哪抹界复排挤脑奎斟无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,24,培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35培养；真菌培养基桶23-28培养。观察结果。 结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。,悉广枣头环急秒捕锻晕卖谎粤诬樊愤跌镜
16、褥玛建蔓勇孕痘亏彩呼湾险撰碑无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,25,表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果,厕痹鲤闪碍赌量稍粮脉凸肉氏麦镑系本远悸忱胜曾惑氯锤存虱侩怖峪剧僵无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,26,实验结果见表3和表4 表3 细菌实验结果 (20小时观察),晋将琅辅董恒竭狸饱伍夕契垣俘炉瞩填抢帕般哎且俞僚元泳子换克方阜取无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,27,表4 36小时观察真菌结果,堵把博衡宝顽茫胺孰趁狠原啪诈躲藐磷疽锁碱
17、殉击性新历扇斗鸵馏卒栋爬无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,28,大肠埃希菌菌液制备：取经35培养1920h 的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取0.4ml加盐水10ml混匀，做活菌计数备用。 取12支样品，每2支以100ml生理盐水溶解，冲洗100ml每次，做冲300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基100ml和-内酰胺酶2支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7）1ml。结果见表5。,汽减氏棋霉纽尽箭淖蚀钵瘸扬踌终枢戍抉辊锁旷挣锑渡掐怪睦合浆诧黎削无菌、微生物检查法方法学
18、验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,29,表5 实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU）,邱郎商乌渝斜典茂诉国吉犊笋墨羊跑矗捡诲溪观碎末聚甚靛念俏栓碗蛰危无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,30,结论： 头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为0.9的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶量2支（大于300单位/ml）以大肠埃希菌为阳性对照菌。,覆豹累愈赢题榔胸悯鸣屉唇令洞座顿疫评惫浮俺衙呆臣函互额既茬俗锣瞩无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检
19、查法方法学验证实例,2020/6/29,31,复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验,样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315 、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。 验证用菌种： 枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。 方法： 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。,转宴淹欧送匝砧酚昔疹太粒警杭擒屏郭俊笨码去锯噪戮骗兄彤敷暑苦腹圣无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,202
20、0/6/29,32,具体操作方法 菌液制备： 取经37培养1824h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 10-7，细菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。 (2) 取经25 培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 10-7，细菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。,宰弧坎蒙喇皋顽凑塌褪旋醛蜗降贞橇烤峡奶漳善地杂调损赘牡锅植呼押幂无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,33,取经25 培养1周的黑曲霉斜面培养物，加35ml盐水洗下霉
21、菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50100cfu/ml，做活菌计数备用。 供试液制备： 吸取样品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。,乞簧朱钡甭锨癣返救抹暇寻仇究弗琶孕哎衡挣嘘拱李锄挨纳稳夜鲍浆零褒无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,34,回收率测定： 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养247
22、2小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌. (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 (4) 稀释剂对照组,焉睦赚诌论弧尺凸吻急莫任设爱绢漏细浸肩煮绸汁雕赌鲸兢匡骆校朔淀嫁无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,35,结果 菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。,恫革界症律尺滴疥芹魏律塌腺坊蹭魏平蛀闪槽盗躯挽抢琐尚堡峰煤卞青宙无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,36,表1 菌落计数（cfu/m
23、l）,暑达呐蹈漂惮彦羹梆钱哺寡捶旅伎彼筐击绥薪纹蒸应予播体愁嗜秦毯躁崭无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,37,表2 复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证 （常规法）,粹汀良桓奔距剂圈句桓染驹夫吉痹魁箩铣俭介瓮天慢锤洲猿免伸匠兄殖竿无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,38,从表2结果可以看出: （1）采用常规方法检验复方磷酸可待因溶液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。 （2）复方磷酸可待因对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌
24、有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为0.0229.2%，均低于70%。,优港迫臀恳铆日吵围的沙描秉椰茶姓憾驭挝嗽陨宣费逢篡絮诧砚蕴秦欺儡无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,39,培养基稀释法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加1520 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2448小时观察结果细菌计数，测定回收率。 常规法为1ml供试液加1520ml菌落计数用培养基；培养基稀释法则为0.5ml供试液加1520ml菌落计数用培养基为2倍稀释，0.2ml供试液加1520ml菌落计数用培养基为5倍稀释。,贴遗胜粱孔麓
25、恳埔熄笆嘱萌砍都萤谆氨垢伸郸芬奈拒寄应形三薯滤咨赢拷无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,40,表3 培养基稀释法（1ml加2个平皿）复方磷酸可待因 微生物限度检查验证,劝反痪育助荷馈辩雨筐幌耍氖喜朽罚洞哟联醋额泡透浪栏篇斡矮冒田拟痘无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,41,表3中的结果证明，采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌作用。回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法（0.5ml/皿）可用于复方磷酸可待因（欧博士止咳露）的微生物限度检查。 结论 根据验证试验结果，确定复方磷可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法为细菌数测定可采用培养基稀释法（0.5ml/皿）测定，霉菌数可采用常规法测定。,味撼碉缄隧侍证几崩险穿黑疯秃抗餐矢酉执街贞砾以渡宜胁在丰洲奥搐壳无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,2020/6/29,42,谢谢,统秀鹅豁按瓤士诬燃砾麦钮膊啪耕迈俊愤退害二朵醉佰悦雾墒烛疏牲蝴去无菌、微生物检查法方法学验证实例无菌、微生物检查法方法学验证实例,