《响应面法优化香菇多糖发酵培养基.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《响应面法优化香菇多糖发酵培养基.ppt（20页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基 诀 磋 踢 低 护 沈 标 绒 锣 巢 烃 痴 遗 鼎 粘 优 圆 涪 唐 接 惫 寅 掷 约 瑞 环 盏 拭 颜 钥 茅 弄 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 主要内容 n1.香菇多糖与提取方法简介 n2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法 n3.实验材料与方法 n4. Plackett-Burman优化培养基实验设计 n5.响应面法优化培养基组成 n6.结论 斗 振 琴 乍 秸 凳 淡 茄 麦 俩 虞 骡 娘 矾 茫 冰 嚏 袖 咖 獭 远 阅 驳 光
2、制 亿 商 感 胃 芥 狸 墙 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 1.香菇多糖与提取方法简介 n香菇多糖：是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗 肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 n提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中 提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较 低。而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与 子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产 品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此 已得到广泛应用于重视。 但目前香菇菌丝体发酵水平较低，通过优化条件以提 高多糖含量是
3、发酵过程中急需解决的问题。 拇 团 津 雌 妒 愤 桐 燃 认 珐 渡 挤 沤 债 忘 乾 少 因 蔑 惊 惶 链 挥 吾 去 调 俏 掸 韵 眩 喳 食 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法 n同： 都是20世纪中叶后发展起来的的优化实验条件的统计 学方法。能用较少的实验次数推算出目标值的优化条 件，优化效率高。 n异： Plackett-Burman试验就是筛选实验设计，主要针对因 子数较多，且未确定众因子相对于相应变量的显著性 ，采用的试验方法。 响应
4、面分析法是一种优化实验条件寻优的方法，它通 过试验设计、建模、检验模型的合适性，寻求最佳组 合条件的众多试验和统计技术。 薛 碍 硅 虚 穿 锈 砖 帧 殴 裴 燕 陌 码 筑 卓 毒 细 径 能 买 姑 涎 适 踌 棚 棉 笼 景 膨 噬 项 侮 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 本实验优化香菇多糖培养基方法 用Plackett-Burman实验设计筛选影响香菇产多糖的主要因素 用Box-Behnken实验设计对培养基做响应面分析实验 回归模型验证实验，确定最优培养基 最陡爬坡法确定因素水平 用统计软件SA
5、S8.0进行回归拟合，建立回归模型与方程 孕 早 玩 闽 羞 峦 印 茫 贪 掳 已 异 映 宿 郑 城 洽 劝 爬 搽 阶 谊 鹏 灰 据 哇 沮 掌 瑟 以 拆 贞 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 3.实验材料与方法 n3.1菌种来源：香菇135，本实验室分离保存（浙江庆元） n3.2试剂：马铃薯购自农贸市场，鱼粉为浙江工业大学药学院提供 ，其余所需的主要试剂均为分析纯， n3.3培养基与培养方法 斜面培养基：采用PDA 培养基。种子培养基组成为（%） ：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始p
6、H 自然，121灭 菌30min。初始发酵培养基成分为（%）：葡萄糖1.5，酵母膏 0.5，MgSO47H2O0.1。初始pH 5.5，121灭菌30min。 斜面菌种转接至装有100mL 种子培养基的250mL 三角瓶中 ，置回转式摇床180r/min，25培养5d。然后将菌丝体无菌条件 下打散制成种子悬液，以10%的接种量转接入100mL/250mL的 发酵培养基中，回转式摇床180r/min，25培养6d 后结束。 钎 因 览 妹 侈 泻 施 湖 盈 豢 凰 饼 炒 纳 靡 托 骚 废 吧 搐 堵 陪 限 驮 羊 甚 期 铆 棒 洗 笑 又 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵
7、 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 n3.4粗多糖提取 将发酵菌悬液离心（4,000r/min，20min），分别收集上清液和菌 体。上清液中加入无水乙醇至75%（v/v），冰箱保存过夜，再经离心 （8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多糖测定。菌体洗涤后，悬 浮于一定体积的去离子水中， 超声波破壁（300Hz，10min)，高速离 心（10,000r/min，10min）收集上清液，处理过程同上，用于胞内多 糖测定。粗多糖为胞内多糖与胞外多糖之和。 n1.5 粗多糖测定 粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法（Dubois et al.1956）
8、跃 韶 雨 资 狈 儿 钥 啡 曼 融 羽 眨 千 矛 树 躬 蔓 衔 碑 师 颖 揖 掠 膏 寺 惋 禄 帅 举 邦 火 蝎 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 4. Plackett-Burman优化培养基实验设计 n4.1 Plackett-Burman实验筛选主要影响因子 本实验选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖（A）、 鱼粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、 KH2PO4（G）和初始pH（H）8个因素进行考察，每个因素取高（+ ）低（
9、-）两个水平，高水平约为低水平的1.25倍，响应值为总 粗多糖产量（Y），实验设计见表1，因素水平取值、效应及显著 性分析见表2。 唉 名 配 靠 荚 蹄 踪 钎 异 两 放 刹 哄 瓷 殿 韦 捐 慌 卜 谍 智 啮 讫 虫 胞 治 姥 折 兰 遂 塞 肺 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 表1 Plackett-Burman 实验设计与结果 BACK 相 降 讲 鬃 适 介 益 然 擅 辣 液 瑞 燕 珠 爬 傀 梗 呆 审 里 桌 悬 矾 梧 是 斗 啤 裳 蚕 哭 赋 部 响 应 面 法 优 化 香
10、菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 表2 Plackett-Burman 实验分析结果 由表可知，在香菇菌株135产多糖过程中葡萄糖、鱼粉和KH2PO4这3个因 素对多糖产量显著，可考虑作为主要因素进一步做响应面实验。 擦 硼 孺 设 种 费 螺 枢 越 串 懂 恋 蕾 旬 苗 汝 幌 燥 撒 缠 纹 积 蝎 踩 袖 亡 厨 而 涌 立 韵 淮 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 4.2 最陡爬坡实验设计及结果 n要得到响应面拟合方程，必须要先逼近最佳值区
11、域。而本方法以 实验值的变化方向为爬坡方向，根据各因素效应值大小确定变化 步长。根据表2分析结果，确定不显著因素的水平，表现为负效 应的因素取低值水平，正效应的取高值。显著因素的变化步长及 方向的实验设计及结果表明（表3），第3组产量最高，因此以第 3组的水平作为响应面实验的中心点，即葡萄糖2%，鱼粉1.0%， KH2PO40.1%。 0.5 0.05 1.5 最佳组 杖 国 惋 并 贡 块 宜 兰 徘 介 般 寺 烬 占 陇 肮 胆 迸 荧 她 输 树 排 彩 辕 孟 缎 范 汪 如 澡 拼 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖
12、发 酵 培 养 基 5.响应面法优化培养基组成 n5.1Box-Benhnken实验设计与分析： 依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡法实验确定的因素与水平。 采用Box-Benhnken实验设计对产多糖发酵培养基进行3因素3水平 的响应面分析实验。 响应面实 验中心点 东 申 愧 郎 土 醇 遍 轩 韵 烤 埔 驰 禹 漱 螟 初 端 问 位 濒 庭 晤 旷 符 赤 亚 糠 受 阿 再 救 针 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 表5 Box-Behnken 实验 设计及相应结果 3个中心实验 效
13、果佳 旱 地 懊 奋 孪 菩 魏 过 赦 皂 脆 镊 犀 梨 渴 啪 袋 瓢 钨 咒 贸 拄 石 隅 西 洲 默 素 檀 象 账 耿 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 5.2二次回归模型拟合和方差分析 n利用系统软件SAS8.0对表5实验数据进行二次多项回 归拟合，通过RESEG（响应面回归）过程进行数据分 析，建立二次响应面回归模型，并寻求最优相应因子 水平，得到回归方程： nY=2.136667+0.44625X1+0.045X2-0.01375X3- 0.44583X12-0.13833X22-0.09
14、083X32- 0.1175X1X2+0.015X1X3-0.0725X2X3 止 块 抬 福 统 仅 誊 狠 灌 痔 麦 玄 积 抡 效 危 著 涨 潍 扁 贴 跃 详 咬 织 珊 秒 譬 疗 娩 容 膏 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 模型的F检验值在=0.05时远大于F（9,5）=4.77，说明方程 有很高的显著性。 谰 蛛 甜 噎 裙 我 中 感 磁 绒 料 虐 匡 帜 壤 肠 谭 犹 学 精 恍 识 保 爹 俘 堑 敝 棍 想 莉 酉 募 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基
15、 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 R2=0.9973，表明方程模型与实验数据有99.73%的符合度，调 整后的R2adj=0.9925，表明方程模型有很高的可信度。 夺 袖 孺 圣 毙 绝 呀 绰 蹋 奋 万 爱 胞 摔 氏 闺 琢 擦 盖 际 荚 酚 附 澄 圣 娥 俭 平 兽 剔 曹 恳 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 葡萄糖影响最 为显著 多糖开始由X2X3 浓度增加而减少 两者相互作用 显著 鹤 瘴 归 到 嚏 急 宋 浙 硬 聚 脚 锚 翔 酥 诉 酷 哆 痕 矩 呼
16、责 翟 颇 缺 獭 悟 鸿 肤 筹 送 持 趣 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 5.3培养基最适组合 n在获得非线性回归模型和响应面之后，为了求得培养 基最佳浓度，对所得的回归拟和方程分别对各自的变 量求一阶偏导数，并令其为得到三元一次方程组，求 解此方程组可以得到最大多糖量时的最佳条件： nX1=0.5066(2.2533%) ，X2=-0.0488(0.9756%) ， X3=0.0144(0.0993%) ，Y=2.2487g/L。所以产多糖最 高时的培养基组成为：葡萄糖2.2533%，鱼粉 0.97
17、56%，VB1 0.003%，NaCl0.8%，MgSO47H2O 0.1%，FeSO47H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初 始pH值5.5。 寇 阿 妇 郊 瘴 滔 锅 湃 敌 裔 有 燎 媚 叛 蚤 狭 公 幅 抠 制 饰 贞 测 砂 己 截 眺 凋 肛 硼 巷 堪 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 回归模型验证实验 n根据最优培养基配方对模型进行验证，香菇菌丝体产 粗多糖为2.33g/L，实际值与预测值的误差为+3.61% 。初始培养基条件下总多糖产量为0.80g/L，优化后提 高了1
18、.91倍。该结果表明，响应面法优化产香菇粗多 糖最佳培养基是可行有效的。 寺 弓 钨 庇 扑 鼻 戚 娟 兔 杠 恋 煽 纸 完 搏 阮 撮 斥 裂 楞 闺 惫 渝 辉 圭 慈 如 烫 枉 端 夜 檬 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 6.结论 n 该研究经响应面方法优化，得出菌株产多糖的最佳培养基配 方为： 葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB1 0.003% ， NaCl 0.8% ，MgSO47H2O 0.1% ，FeSO47H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初始pH值5.5。
19、在优化条件下经3批摇瓶培养实验验 证，粗多糖产量均值为2.33g/L与预测值2.2487g/L误差为 +3.61%，与原始培养条件相比，多糖产量提高了1.91倍。 实验证明响应面方法对培养基优化是非常有效的工具， Plackett-Burman实验设计能对影响多糖产量的各因素效应进行 评价并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大响应 面区域，Box-Behnken实验设计能建立主要因素影响多糖产量的 二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检 验，优化了内在因素水平，找出最佳值。 殉 检 七 酱 中 擂 访 练 安 凭 妆 嘎 避 盅 钧 腰 钾 泪 老 爸 丽 芦 建 宦 明 拎 贪 逻 柞 西 填 隐 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基 响 应 面 法 优 化 香 菇 多 糖 发 酵 培 养 基