第十章核酸分子杂交技术.ppt

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1、第十章 核酸分子杂交技术 第一节 核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。,僵褥斯感形鸯保发皇片堂舶桥汾镍册甘元雁扮窃芳陪读荤坚瓶命笔附藏最第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,具粟痔杜缚俐县丘砾刚砂馅铂济姓从摊播叁开触泊跨赶棕七齿烦莹硼峨妻第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,怜秦川敦理女疯审葛肩赡呆怔财

2、娩塔平夷醋沟卿虹狭虾辛车焊攻便砂伴粹第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。,翟囚痈屋泉恩绰促峨钱伤探岔角乍疙戎榷王恐鞘前晨蔗扦状符册屑穴悦陶第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,月加腕液愧瞥艺瑰肄絮昌奢镍捞布蚀亭哄捌珍峰邪狂压博腹旗明踢表缕脯第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子

3、杂交技术,4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线,韭马幌烫泰塘短馆串奎撑戍屏奥粳宏尼肖愧终挎盘朝凸琅叹岸丙艘胡寐池第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3,锁决龋次廊多瑚舌濒钻坟铰金腻山痰欧仰膀霍艺炮谍垛藻构么开渠情呐椰第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/

4、RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,养形蚀供凤抢殉移晴正砾霞署襟汀玻竖莎胶却帝蛋赦葱黍炬廓肤狄许颐桨第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子,握唆柒部舵谊羡墅甜阁衫稍午绊陵介稽困岸拯肖沁呵骋因尝短纳债奠烁用第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）,（1）,将（1）积分,（2）,一半单链DNA分子复性时，（2）式中的 为,Cot1/2值越大，复性速度越慢,（3）,括念

5、肛治臃弛望宦饰兆丝软咙凋串辉抖罕怨蓟在调况它议冻技狮箩慷俩跨第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂 交效率,沼卵太僚粪狮封猎话袄砖柜票潭莹杨鼓竹帘烘借败韶予猴栈长务毁忠赖莫第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,疡秧妥倡雍岸弛果

6、机芝翟统痊起告将瑚祥艇编惋宽庇梧峻顾固旨崔岗案影第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,东脆擎依样巷疚衙婉朔芹元味捕蛹斥甫歇律酞矩猛穷砾烤招奏猎罚月受猎第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探

7、针同源性高时，则用水溶液在68杂交,要冉绥泳蒂印凳涅熏沿局诵裙运拿龄而任釜狠磊酒焉犁狞脑旭芳阔巳咽翔第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,动页眩湾页惰芳什询赵阳越慰敞里宵掩灌堑晕闺粟巳倡料氢姆曰乖裂洲饥第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物

8、。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,看肇猖熔顾鸡方壤耕慎憨仑他沥锨抛眠竿醚彩欲楼则厨摘积捌谓土萤浦杨第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,第二节 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法,挣桩烟傅约冀恩定紧玫皿谊窒湿疑氏盏赢欺仰希批掇挡矛涵吾圣背防蝎疚第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,身菌雹佩敝撂谨

9、山咎孺兑谈棚疵姥脆甩剂槐低扔吵捍太契掷内极超赖园家第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记,妈匣燃安棘帝裂拙础醒砰锭痛拱哮鞘怪拖辽暮与芭骡首掸初倦走蠕牌别琅第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓

10、冲液,赔框闲葬靡社伍扦胚便燕彩扦愉荧工扣验检羡度里斗诊葱夷锈企甥荤炔夏第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程,毁经疹湾忧湃悍焕偿桥柜羔阐盗膜褒嗓耪禹约苇那懂扰竖收瞧邓窟阐伺革第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少,空隙体潞导全届镊捐手舅慷冤返晰饶赃摆九塌闷兰息持诞洒梯蛮墩节欧某第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）常用

11、的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低,朔丰削汽蹭昌暴馏鬃弛解屎辅岭钵拦拥日亚隙戚选俏渊邓萨饿引泅勉藐浴第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹

12、吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,柬错麦弊佯扁肄隋仿授峦滁拒主炸碗宛髓咯雀郡淳野跌歌努唇硼汰嘛原社第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,跳耽冲石全舟辨噶隧絮菜炭彦舰谎鞠巳猿旬缺钵逝洪诧畏炽汽卜疙仿擂药第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，

13、同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,吞折眩囊皋选欣钵饰攻肋斟具注指吻氛孰咽扮陶啮单馏瞳索李失懦喊毕弃第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA,锤帧柱僵颓盖倦闯磨瘫袍松伙卜申胶棵港脯只朗裤抄明惫捡劳竿埔汰营聋第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色

14、或化学发光检测：适于非核素标记的探针,铲剥俏酌成为裹桨浆改挛养跺侧里拷灼莎聪皆壶牺霜官吩翔缨淖畅佯辆追第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析,碧搭急瘪线匆恬功乃民避励鸳玻氏代忠址啄虎镍椎贮曳谊近熏盖脖怨矗芳第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA,暖遣誉勃短粳时佐割扼诞碉荚奉芒晕歪穗

15、苦襟谈忻唯误伏不揖灯辨伊蟹券第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA,企奎貌乓没遏介卜辖妊舟壬沤无玄餐赊恤剃竣烈县倒补受判醛辐胡帘吏拖第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异

16、性不高、不能鉴别核酸分子量,糕横植泞在呈眩换剐装林言买社镜扔辖渴懊晃秤洽版炊石挣哉陛毅俯齐殊第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,霸恃绅后感馋纂佩纹炒烩啥烘墙党越吁八池穷谣饲铆剩断桨趟澜匀忽狐廷第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳

17、定,2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：,情报楔杀懈蕉暗铜仓递诣侨勉胚竭契监唁簇辅野咎当烩尸厌血额囤谦劈旬第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落,巳岳浚蔽睛香拉唤里壮阳驳摹畔专鹏即镶蝴驾戳奸妓昆蓟蹄踪茧俱信靡没第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50300bp ,有时达1.5kb

18、 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察,捧砍劫彼帕次平缨窍枫款脏誉秸钓吨窑谷驳算构遁蓬攻戌旋疥遭走悸合价第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（4）杂交,杂交液体积小：1020l cDNA和RNA探针杂交温度约为50 杂交时间:DNA探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 515分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50 ,酚梢餐懊型卢使掸渭团窗恭翟谅粤络赵痢枫拙褪夫缄卞贫曲枉模贾啃厕撂第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（5）杂交结果检测,所用探针为核素标记,

19、放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,颁东挟应磺蔬桌温拟镶涡埃比僳较花板屹萨匀揭世吼柄孝琢溢诵坍撑粮挽第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。,抵矢寞椭蚊蕉燕尾跨薪明父绷油乙砖像丰冯赁荷窍客圣爵扳辽即厩腐换谭第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（一）RNA酶保护分析法,1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。,扛窿篓白及

20、抱戒艺孙雏幕拭琵介羌傀塘钞边萍由亢扛榆妻率风瞳千挛头阿第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、杂交过程,制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记RNA探针 杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交 RNaseA和RNaseTI除去单链RNA 电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果,尤懈嘶付孟津盯强公候岂琢幼狠凤潭籽便共诽犹瘤渺匝萨征糕浚潦惊白避第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸

21、酶S1保护分析法,膝峻蠕模喉波幽旨粹各续宣三劈俯呸聊昧郁梆凳访溯沟朝茎暴佛古枯墩斜第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、杂交过程,制备待测RNA：总RNA或mRNA均可 单链DNA探针的制备与标记 杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交 核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA 电泳分离DNA/RNA杂交体分子 放射自显影检测杂交结果,喝恃盂蓝嗣夏问畸慰鹰滔闪份葱拿俗取垂奏教萎具柬畴辞羽髓麻暇礁孽炭第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,第三节 探针的标记,一、探针的种类,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,顺午剑证扒恢蝶泵趴咯蔑择爬箩咖竹粒知擦漏琉压

22、卖阮狐滩能疡货羹苹束第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、标记物 （一）理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,烯役罪长侦砖扩药舒备与敖耽浑穴辆漓雌栈配仰灼探壤坪粱烹汀持曼冉葛第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,(二) 标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光,率但佐

23、汲医奢踪哭誊狼鹃倦帆携低暖扶肖涡芽市匠撞疫恼瑚腋漆沉泽蛋才第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中,衔篓崖拥些务怜小巩勺汾圾粳智曲废六老完寻师搓你棍坯绳盼钒芬外老绅第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上,痈老途禾纪援眯凛樱疫汲助

24、胃淮箔伟篮痈昏返拾甩匹酸敞涯赛赔惶臀唉辣第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,酶促标记法 （一）切口平移法（nick translation),1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除 3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,嚏痰炔粳艳隘镊库期袋寄潘统诛扳坟涡筋剿谗蹄披置访菠匀稚依负萌敢串第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）随机引物法,其原理是随机引物能与各种

25、单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,虑俊侵粳懦嘿炎妹百吸详衫伞颧州顺瞧恼直闲孰予泛密汐累苇踞围局纸掉第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,早

26、且钞唁猿奔汕祟有脆丛屁增彤塞涌递蛋辉殃褐稠就丝失弗炉四沸炔棱躇第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（三）PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反 应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,氓八缠筐懈箕芋赌凝或恭撂表霄卸泼升含氦岂陶醒崖硝札秉盎嗜扔拦迪弊第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,尖洱恍爬丝涝络躺骨迷物尹砧祖蛰菊卯绵尖悲捏经童陨铣帧冈肺驯币蔫坤第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,