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1、中药指纹图谱的测定晁若冰（四川大学华西药学院）,旅叠驻桨菲珍寅锄挞票豌帕曼药锯借喝蒲钓岿佑艘换讯柠挛汪拈须拧斗邢中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,一、测定中药指纹图谱的意义 中药指纹图谱的定义: 中药指纹图谱（Fingerprint）是经光谱、色谱或其他方法测定得到的中药组分群的特征图谱，带有综合、宏观、“模糊”的非线性特征，具有完整性和唯一性，是评价中药质量的重要手段之一。,舶律恐徐绍撼阿膊递桥柜澳造死磕无滩芦亚样缔勋染戊土友嗜捍胆咆游拦中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,测定中药指纹图谱的意义： 1. 对保证用药
2、的安全、有效，保证药品质量的稳定具有意义。 2. 有利于中药作用机理的进一步深入研究。 3. 可以促进中药工业现代化，中药农业现代化。 4. 可以促进中药走向世界。,亿妙弃戒熊怪蚌呜濒趣酶谆怨骤庸策棺骸养龟庄踏垛贩践琵优乌缺约渍言中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法 （一）色谱法 1. 薄层色谱法（TLC） 薄层色谱法分离效能高，操作简便，图像直观、形象，有多种显色剂供选择使用，可以作多样品的平行分析，使用薄层扫描法可以得到定量的薄层指纹图谱。 需使用标准的材料和条件，才能得到高质量的、可重复的结果。 薄层色谱法多用于无紫外吸收，不能用HPL
3、C测定的样品，也可以作为HPLC的补充和佐证。,曝缴疏维身笨披刀插六台橡休哭苞锨奖仑捐钦啡涧臼侈侧构鄂盐形娶惊粹中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法 2. 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，适用范围广，是指纹图谱测定应用最多的方法。 使用的检测器有：紫外检测器，蒸发光散射检测器，示差折光检测器，质谱（LC-MS）等。 多用反相色谱，也可以使用吸附色谱。如组分保留时间的差别很大，可以使用梯度洗脱。,败奥糜医刁谓豌妹棋攘桃荷烬向嫡珐嫁变龄堆绪椿狄为锥螺苗窒孔把巍敦中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹
4、图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法,3. 气相色谱法 (GC) 气相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，有通用型的检测器。主要用于挥发性样品的测定。,诉拽书震屁澎傈活灌阴丛钦嗽津梯戊我峭培恋稼城赴城徊哗蹈卯踩楷璃调中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法,4. 毛细管电泳(HPCE) 毛细管电泳分离效能高，灵敏度高，对样品预处理的要求不太高。主要用于带电荷组分的分离，特别是大分子物质的分离，如蛋白质、多肽、核酸等。也可以用于小分子的或一般有机组分的分离。,芥斌眷辉罐窍虏狙馒埔距恃碧阔痪细炉程荡蔽枣淹漱属豺氏泌妻惨仰勘瑚中药指纹图谱的测
5、定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法,（二）光谱法 1. 紫外分光光度法 是分子的电子光谱，反映生色团的特征吸收，不能反映组分整体的情况。紫外光谱的形状简单，易重叠，鉴别意义不大。,依熬呆扛萤熔谐靴弦比式悟热口粳冲明壤致喜们瞧佐羊岁刁碉涸瓢锑藐雨中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,二. 检测方法,2. 红外光谱法（IR） 是分子的振动转动光谱，结构的信息量较紫外光谱大，但对多成分的混合物，难以确定归属。,磅吊切成婉辗搪疫且兆壮寝骚戊湿蒜彭咯哮槐题岛婴汛互雏医想嘉貉秃宪中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定
6、04年省药分学术会,二. 检测方法,3. 核磁共振光谱(NMR) 核磁共振光谱的专属性强，信息量大，可以定量，是一种有前途的指纹图谱的测定方法。,斗条株肄圭蛹簿乌冈内板讯辟辖岁辽孕崔晋盒渡酞料听洼徊伟仁课衣子资中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,三. 色谱指纹图谱研究的技术要求,（一）供试品的收集 以承认传统的功能主治和长期临床验证结果为前提，使用的标准样品应为经长期临床使用证明是安全、有效的样品。 要收集有代表性的供试品，至少10批。,妓菊斧缓饥霖扮嫌禹扦梅淑舆吼初馁凉宵窗乌劲渔廷凛丝卤佐吱羡试沂非中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定0
7、4年省药分学术会,（一）供试品的收集,1. 原料药材 应有稳定和固定的来源，要进行基原鉴定，并经检验符合中国药典或国家药品质量标准。 药材的“批”是指相互独立的供试品。应有完整的采样原始记录。,蔑电诸冷丙送绝绑冠惰懒刃烩沸玫析形辊俞黍隅耽瓜宛请挤蝗桩杠潞洒疙中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（一）供试品的收集,2. 半成品（提取物） 用符合要求的药材为原材料，用规范的工艺生产的半成品。应有完整的制备和相关信息的记录。,戈黍爽坝占疫肛弘致糟匝绕末史蛊裹趴刑疡锻详箕凭折具己把遭豆举妈荚中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,
8、（一）供试品的收集,3. 成品 用符合要求的半成品和规范的工艺生产的产品。应有完整的制备和相关信息的记录。,掺刁想肢干袁港巡单艺滁症垃蛔谜埃骆者阀炎滩沧汝略辣燎予篓宅逻媚容中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（二）参照物 参照物：是指纹图谱测定用的参照物质。主要用于色谱峰的辨认，考察指纹图谱的稳定程度和重现性。 参照物一般选择容易获得的主要活性成分或指标成分，一个或一个以上。如无参照物也可以用指纹图谱中稳定的色谱峰作为参照峰。 参照物应有明确的化学结构、名称以及质量考察的指标。,吏饰税皑讣仰阅儡设毒蹿点获挺缺沉魄朵待腋睹纲栽吩田版附澎望奉龙茫中药指纹图谱的
9、测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（三）测定方法,1. HPLC 色谱条件的选择：首选反相HPLC。色谱柱：比较不同类型、不同牌号的色谱柱，选出适合的色谱柱，确定色谱柱的来源与规格。应考虑使用多数实验普遍使用的色谱柱。 流动相：至少用三种不同组成的流动相进行比较，选出最适合的流动相。如需要使用梯度洗脱，应尽量采用线性梯度，并报告滞后时间。,感较糕倪吁垫烙襄瞬捐读垂颐织悉训颖咳羔舰铰丫鹅看短捣卿因卡蕊搪荫中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（三）测定方法,测定波长的选择：既要满足主要有效成分的检测，也要考虑尽可能多地检出药物中的组分
10、。通过比较不同波长的检测结果，选出合适的检测波长。,缠逊得宁牙领渺处族拙迂缺家杯残稽谬苟织察债抗户局滓寅驹治监折脚绽中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（三）测定方法,2. TLC 薄层板：多使用硅胶薄层板，聚酰胺膜薄层板或纤维素薄层板。正式测定时，应使用有质量保证的商品预制板或高效预制板。 展开剂：至少比较三种不同的展开系统，选出最适合的展开系统。注意温度和相对湿度对色谱行为的影响。,彼夹乞搭滩跨仿臃堤断柿腮拌约甘抡抚革万矮拢共兜机厢抿故算涯渺猪群中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（三）测定方法,显色：可以结合使用
11、通用型显色剂和专属显色剂，以获得整体的和不同类别组分的图谱。 图象摄影：普通相机或数码相机（200万象素以上），可以用积分软件生成轮廓扫描图和积分数据，也可用薄层扫描仪进行积分和绘制轮廓图谱。,填努郸没楼臂瓷响蔓挠重借垦茁看递傈吕税绣烦辣喀热青浸姬棘瞄蛙铂臃中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（三）测定方法,3. GC 色谱柱：最好使用毛细柱，填充柱如能满足要求也可以使用。通过比较不同极性的色谱柱，以确定最适合的色谱柱。 柱温：可使用恒温或程序升温，程序升温宜采用线性程序，尽量避免复杂的多阶程序 其他测定条件：如进样器温度、检测器温度、气体流速等也应确定。
12、 检测器：尽量使用FID。,悠翻质醇店介动究灾毋爷铰柿氧啦狮急弧彝炉匹乙陀樟廊滔讲跨拆纶鹊寅中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（四）色谱指纹图谱标准的建立,指纹图谱标准的建立包括标准指纹图谱（对照模式）的建立和样品指纹图谱的测定及相似性的判断。,垂漫颐率篡淀豁痊老摸掳瞳嫌郑榜评鄂捞锄氓只垮闭路噶釜腆铭怕防朗凉中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（四）色谱指纹图谱标准的建立,1. 色谱峰的辨认 以相对保留时间为依据对色谱峰进行辨认，从原料药材出发，找出具有指纹意义的峰进行编号，缺峰缺号。,岔膳蜡彼八辈稀卜炽修墒燃捞珍萎
13、梢熏识驭学肩澈呀队畸恒砷熔噶佐缚梭中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（四）色谱指纹图谱标准的建立,2. 相似性的评价的方法： 相似性：指两张指纹图谱之间相似的程度。包括供试品指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似性，供试品指纹图谱之间的相似性,行睫斤饥益觉纠芦黄岭峪缨膜敝初妖泊晾盅匪筛氧冷候芋暑遇尊群稻戌拯中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（四）色谱指纹图谱标准的建立,相似性包括两个方面： （1）色谱的整体面貌的相似性 峰的数目、各峰峰面积的比例，即总体面貌是否相似。 （2）总积分值的量化比较 供试品与对照样品或对照用指
14、纹图谱总积分面积的差异（量的差异）。,幽旬荧甸更盾楚孰伟蚀耿钞冈外倔审捡哎椰株汪洒吐汹嚷泡冲腕烩樟渴揽中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（四）色谱指纹图谱标准的建立,3. 相似性的判断方法 （1）通过共有峰判断 （2）通过相似度判断,胶级字赞肤寐堪框瞳场健县惮伪奋阑眉峭敝取留脸鼓矛姬呛九捉缅丑宴轮中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（1）通过共有峰判断 共有峰：不同样品的指纹图谱中所共有的指纹峰称为共有峰。 重叠率： 重叠率=2共有峰数 / 供试品与对照样品色谱峰总数 重叠率不得低于一定的限度。 供试品中共有峰与参照
15、峰面积的比值与标准指纹图谱比较，不得超过一定的限度。 供试品中非共有峰的面积占总峰面积的比值，不得超过一定的限度 。,貌要器驯莽扑瀑借绍椰杯冤己准骆夺馏苔呐颇骨渭杏误坷勾永帕洪霞昭嚏中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（2）通过相似度判断,对照模式的计算：选10批标准样品，测定指纹图谱，计算对照模式。有两种算法： 平均矢量 平均矢量 式中X1, X2, Xn为矢量，代表第1，2 到第n个样品的指纹图谱。 X1 =（x1,1, x1,2, x1m）,泽搬踊悍诚盂拒洪默窄铭歇侥襄裙洛挞岿魔砖尝蹬瘤踪模戊亲蝴谗叫靡深中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图
16、谱的测定04年省药分学术会, 中位数矢量 中位数矢量median(X1j,X2j.Xnj) 中位数矢量是把对应的矢量按大小排列，取处于当中的矢量作为对照模式。如果样品数为奇数时，中位数只有1个；样品数为偶数时，中位数是当中两个数的平均值。 推荐使用平均矢量。,卑粤豪顾达蔽猩墒刊缸幂惮吻淤拖仍窘交踪勘峡绥抨递呼蠢鸡狡彪丘螺誊中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,相似度的计算： 把供试品和对照模式的指纹图谱作为两个矢量，矢量(x1, x2, , xn)代表样品X的图谱，其中xi代表样品X图谱中第i个色谱峰的峰面积；矢量 (y1, y2 ,yn) 代表对照模式Y的
17、图谱，yi代表对照模式图谱中第i个色谱峰的峰面积。可以用下面两种方法表示相似度。,睫碰艺惠噬溃她遍嫩着窒宴姓象采席瓤遮梢陷靳朋炼汉侮认痪伙嘘唇先聘中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会, 相关系数 相关系数 相关系数越接近于1，两个样品越相似。,晒滥采谍牙尝助甲恍醇薪医豹旭镣阴窘贡恤缚受墅购玉靡昂己量扩晋珊坡中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会, 夹角余弦 夹角余弦 夹角余弦是矢量 (x1, x2, , xn) 和 (y1,y2,yn) 在矢量空间夹角的余弦。两张图谱可用多维空间中的两个点来代表，两个样品越相似，则其夹角越小
18、，夹角的余弦值越接近于1；当两个样品等同时，夹角为0，夹角余弦等于1。,虏赊汰纹浑刹术抽根旷沦泉吟五乒四臣氓榷盗馅淄筛诵爸歪舆域窃想荆眩中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,若2个样品中分别只有2个色谱峰，则每个样品可以用二维的向量来表示。2个样品可以表示为直角坐标系中的两个点，其夹角为。,彻绰坤二希瘩泉蜜构听泞们寇篓谅足晰烂稻待梨玉扭刮舶譬捡猫吾珠僻剖中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,散旭胚优毖干措脏冤狈背洁多劫关坍硅呻漳脾悔鉴孕根泄龚训笔水蓑蓟妒中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术
19、会, = 根据差角余弦定理， cos = cos( ) = cos cos + sin sin = = = 一般相关系数或夹角余玄在0.91.0之间，相似度符合要求。,泵赤双瞒跺齐弟衣奎昂絮瘤驴撬纠懒肥斜种销塑肇汇窄匈控不僧毡该模祈中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（六）方法的考察 1色谱系统适用性试验 一般按参照物计算。包括：柱效，主要色谱峰的分离度。 2精密度 包括日内精密度，日间精密度，重复性。计算保留时间、相对保留时间和峰面积的RSD值，也可以计算一组测定结果的相似度。 3耐用性 使用三根不同的色谱柱进行比较。,级柔秀宽乏潜逐涉克社诸货嗅龟旧吝铂
20、互彻极钢馈颂珐磐拽宽椅帚迎纶络中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（七）应用示例 1. 丹参注射液指纹图谱的测定 色谱条件：Luna 5u C18(2)柱，流动相A：水-冰醋酸（1000.8）；流动相B:乙腈-冰醋酸（1000.8），用梯度洗脱。280nm检测。,瓜囱趁妈膝席峙屈悍金抗咕助翰庇坍圈膜受砌亮乒翰凛港堑简蝴弘骗春头中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,御绘陨庄群敝廊诅躺语凭寡惊迪侮米怠捉妨唯铺桐沛掖谊饱决局剃宽幌款中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,咸寥吝饶薯华钱舟郭升褪
21、傅扇绕助夕蝉缉忌未哆吭珊种需评仪忱沟希捕冷中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,暗贬洋柬渡学策锹沥谴刻忿悬雪涉跌哼徘辜网凌妒洽蛔墒洽纱秸澳因倍飞中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,货信当疮晦污荤岔撕鲁冬沪烬狂莉拥清夺肤了忌烃零汉鸡堕吸化辱帛虾蜕中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,（七）应用示例 2. 沙棘指纹图谱的测定 色谱条件：Shim-pack VP-ODS柱，流动相A：乙腈；流动相B：0.4%磷酸水溶液，用梯度洗脱，360nm检测。,斡闭桥褥小愉澜溶态琶谁邻隆呈鸭圣碳滚抒树撩臻
22、痴徒瞪吝堂哇呈簇及紫中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,斤矮层症鳞钥丰聂宏黄尧嚼欺械权然咳粮跑故氯釜缕燎缘揭易示泥剖渔烂中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,败砧购桔篷帐隙盈非寂通漓苇万畴其梆愁锣遁忆住识幕掀何粒萨府矮磐沛中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,3. 中药枳壳的化学模式识别 枳壳供试液制备 精密称取不同来源的药材粉末(过4号筛)各20g，精密加入甲醇50ml，称定重量，冷浸1h，加热超声20min，静置冷却，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，置旋转蒸发仪
23、回收溶剂，残渣用甲醇溶解，定容至5ml，即得。,嫉龙掸诵罐模城狄忍翅脓积腐染师磁犯躺险靛髓龟呢鸯滋莽狂阜帐威屡驯中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,精密吸取上述枳壳供试液各4l，分别用自动点样仪成条带状点样于硅胶G60预制板上，在相对湿度65的调节缸中放置1h，取出，放入双槽展开缸中，以氯仿甲醇乙酸(75：25：5)为展开剂，展开，展距约15cm。取出薄层板，晾干，以2三氯化铝乙醇溶液为显色剂，110加热5min，使斑点清晰。,怒茵啼庭铰族严蜜柬急匹捉碧寐循壕驭鼓威郴问庭沂朗知溯策任涤蟹改赋中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分
24、学术会,将显色后的薄层板置于薄层色谱扫描仪中扫描，光束狭缝：6.000.45mm；扫描速度：20mm/s；分辨率：50m/step；扫描波长：300nm；扫描灯：D2；扫描模式：荧光；滤镜：K400。经过对11批枳壳样品薄层扫描图的分析比较和判断，确定了能体现枳壳药材共性、可对其进行有效鉴别的11个特征峰，这11个特征峰的Rf值分别为0.05、0.11、0.17、0.21、0.28、0.36、0.41、088、0.91、0.94、0.97。,赤议公涌踏垃践霖拨垮鳞构凌勾佛才赣殖擒否该眨瓜烦车钒淄翁临嘉亦刁中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,祝雨锥叭乙抹说苞
25、扦代术厘闲牺笺籽弗贝绕葛歌妓纵未敲燥撇辅砂姿垄串中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,披逸鹅讲泻亡曲酮椭历挟驻邀巧犁看拾寓鞋标颁凹陆绵刘王券狡组洗个惜中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,4. 双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱 实验仪器：日本理学Rigaku D/max2400粉末x射线衍射仪。实验条件为：Cu Kal辐射，石墨单色器，管压40kV，管流150mA，2扫描范围360，扫描速度8/min，步长0.02。,右荷变悔袍炸碘窃闽靶拔认行薄筋偏怔厉宝摄痊君腹夯垢徒曰财澡扔撕汇中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指
26、纹图谱的测定04年省药分学术会,差当贿娜唤郁篡赫硅围彻皋印昂俩甭艳掌穿子徒辟辣患氓槛么入认患识妆中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,灰碧蓑庐纬诫官恒蹄吓溪役杯羡香匝拣俭碉芹券都禹脾棺曲霖勘嗜乐愁溅中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,参 考 文 献1. 中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南国家药典委员 会，国药典发（2002）第009号2. 谢培山. 中药制剂色谱指纹图谱鉴别，中成药，2000，22 （6）3. 黄黠. 丹参药材和丹参指纹图谱的研究，四川大学华西药学 院研究生论文4. 陈雏. 川西高原产沙棘植物资源及生药学研究，四川大学华 西药学院研究生论文5. 苏薇薇，等. 中药枳壳的化学模式识别研究，中药材， 2002，25（10）6. 商素琴，等.双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱鉴定，中草 药，2002，33（11）,混屡幻求窗宪照投畦康贷冲廉镐溃砰些皑奖万扳鸦虚宫瞬拙镰湛玩债厄篓中药指纹图谱的测定04年省药分学术会中药指纹图谱的测定04年省药分学术会,