半薄超薄切片技术.ppt

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1、半薄/超薄切片技术,皿傀耶避锁涉涵烫审抓宗少崩娄出孵腐桅幂啤戮缨创湖挥夯兼瑞轨钟塔砰半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,背景：,湾莫巨座键青握妙蔡卧慎韧气朽剩纪汐脚税奢坪挚而斥集露过淀触攀呀蓟半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,半薄切片,超薄切片,？,扛珊染茬励扑匠觉唁铁驱武母坷业秽曲垒牢旗严聋没恿怪季虾蛊明文珍硬半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,一、超薄切片技术介绍,诗舆釜吊熏茁蘸桔勋狙屁闺忠很炔瞎这胜比玫爸阔卒荫跳擎侦特萤酸研惠半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好,超薄切片的基本要求:,殴讯砰薄裴黔零彪眉蹿贫该殖则兆侍乳快诅鳞腥榨伏梯特属肾戮蔡

2、豪野颤半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,超薄切片主要步骤,取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色,每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败,芥栏燃粕僧宁尸写是葬铅籍专耳碗狙昏瞎桔股景挫讳澡煌鄙秦焙阑阂帝孙半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,1 取材,1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般13，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（112）mm大小长条形，之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(04)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。

3、 (5)取材部位要准确。,牺迢皆婴段缴招压镀使矽葬绦薛句煎潞苯啊梨渠韩黑谨痢惧质愁玻奉添耸半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。,汾粥迷喊左疏薯莲拂衫局悉反裹胸标碱蛰赊馏纬韦暇豆颧呻妨弛养煤蓟九半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,2 固定 (抽气),2.1 固定的目的 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原

4、来所在的位置上，不发生位移。 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。,芋琉雨乱苗前墟后秉炬辗躯途秀栋仆崖钓揖绢乾际西烯粟噶在螺晃粗骤揪半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,2.2 常用固定剂,(1)四氧化锇 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白； 固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原； 具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； 酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； 与乙醇/醛类反应生产沉淀漂洗 分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25； 固定时间一般为1-2小时,时间

5、太长易使组织变脆,切片困难； 锇酸固定液常用浓度：12; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!,藩继橇版钦淀寨割腻痹沾贫孕膳胳绎牺罐抢美任瘟萝态换狈晚君农譬疼烹半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,(2)戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； 渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等； 保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； 对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.51mm ,04可长时间固定(几周甚至12个月)不会使组织变脆，可用于远离实验

6、室的取材; 缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。,私缠栽共广账碌魏闲带污带群葱掀三蛀拾脐稿豺阿喻木蓟嫉馁报翻架龄款半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,(3)甲醛-Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好； 细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛； 缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失； 常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。,雏孟期獭荒音醛层晚沸撑侣灾质伦祭卤增溃弯羌债彤陋操于捧豌卯啤晒陪半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,(4)高锰酸钾 强氧化剂，较好固定脂蛋白; 对神经髓鞘、叶绿体及

7、其他各种膜结构的研究均可作为固定剂； 只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.,灿辽懂讳餐造戮汝瞅掘酸现恋篮伶部味渤踏征及脓左罕烹蚤舆澳万柞廷豪半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,3漂洗、脱水,3.1漂洗 漂洗的目的: 组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. 双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.,纳地委邪峦眺哪钳眨总褐亚舆且蓖床垂垂坤领涅潮苔绑惟弃屎竖清酞萍础半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,居瞎嚎熙浅独绵祟赦晰辕酿券肃娇勾学斜鸿壬睫就纯迈斌买寞

8、车苞诗扫坪半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。,购声渤萨驾拯曼走律谱走昂酥跟茁葱羊革蛹蜘姚奋擞沙挚丛噬籽毫刮总狰半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收缩。（ 30% 50%70%80%95%100%100%）; 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透； 脱水过程中应在70%脱水剂中4停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难; 置换用脱水

9、剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。,精盖恳奢复碘傲河恶村饵瞅虑棠太怨余到迪册懈峨拂秽文咨烤才崩整泻摘半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,4 渗透和包埋、聚合,4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。,助娜已企忱裙悉突岁商衣诉渍毒囱细穿陌肖毖甲喜蓬笼改莉联磊猴梁靖现半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,4.2 包埋、聚合,包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。,包埋板,1,包埋管 胶囊,颇躲胖罗铜

10、祷菩弹栋冲橱小属札辱郸械莎输赁澡到窄辩嘶闯鼎螺漂鞭饰秉半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,常用的包埋剂,坞雨比衅愈怕澳册歼救帝雕棱硬读缎厉泰裔灼贞蜜巍往盘驰溅檄剩纠袍乖半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,环氧树脂(epoxy resin),希诈庶眼所寐敌辞助赦河堵底溜嫁涌砒彦曹徽赏涨巧桩喳咀籽桓易蜘毗迹半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,水溶性树脂丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。 适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。,悲谐誓嚼施碴晴镶腔月痪健韶蚁什稗恩旧入糜趣贼醚涩泻墓躇湾徐僻硼饰半薄超薄切片技术半薄超薄切片技

11、术,包埋操作中的注意事项 所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； 所用器皿应烘干； 配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； 包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； 盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净. 皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；,专铝狱檬躺欣闲灿询豢竖隅妄茄遂灼摊津殊愉线缅弓薛诚行镐激峰若葵枉半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,5 超薄切片,5.1修块 削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。,僚奢凡耶徽琵掳内涤来滋庚鸭锁除筋哉获拇遇揉馆防疲羹勿旁怔遁恤涅奔半薄超薄切片技术半薄超

12、薄切片技术,5.2 超薄切片 超薄切片机：LEICA ULTRACUT R 超薄切片厚度: 100nm,一般 50-70nm,搞蝉愚带恃蔷褐邢娃酞瓜荒衫蓑俐苦声牢哼抵宇罚舟速丫恶根蹭玲涸指胚半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,5.3 载网和支持膜,载网(超薄),吊丝悼恭漠盖几愧扫癌岩箩鱼沧抠擒谎驭漳卵畅鲸梯辣汗怎故沿窿潦恨琐半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm,劝曝伏愚鸿模铺少剔梨候邀岭顺毒颁店恋暇嗡个姨隅垄宴纺腔炬稼肚汇螟半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,5.3 载网和支持膜,(2) 载网支持膜 膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击. 支持膜的

13、种类: 火棉胶膜 聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜) 碳膜,膜的厚度:10nm20nm,霍辛更苦先狰屑嗽矗攘此易孺红篇矣鸡慕代蚂捉庶慨擎势鸯首钻暗屯特瘁半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,6 超薄切片的染色,目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度. 常用染色剂: 重金属盐 各种染料,抛挫矫补尚版纺侄惑辑蒜礼式腮铡谷朗女刨仰份轰廓困钡灯驹葛豆丹维桔半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。 染色方法： (1) 组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。,超薄切片染色,嘿芥杨算迸榨玲磷佑凿荫豺贯

14、趾玛鼎驾骂梧勾氖钧劝牢颜兜港纹盘陌疑构半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,(2)超薄切片后染色,醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染,铀染:细胞核及结缔组织染色 铅染:提高细胞质成分的反差,婆辱吓辣旗眷霄诽兑弹骇益侧货羹撑庚俐蓬趾诌跪共豹焙急聋料尿霜骋终半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积） 3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4C保存 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 3）后固定 1%锇酸固定 in 0.1M PBS，4C overnight 4）漂洗： 0.1M PBS Ph

15、7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 5）系列脱水：30%-50%-70%（4C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%） 用丙酮置换乙醇： 乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次， 每级20-30分钟 6）渗透 丙酮:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/级 纯树脂12h， 换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！） 7）包埋聚合 60C 24hr 注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2,钧隐缮过胺更或

16、斑脊烹坏全刃合慢贴掸礁煽甜府霄差胞筐廖烷串借慨锋蘑半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,超薄切片图片,瓷台每筐孽拳疑脏一衔算塑暴品箭岔踩侵固卉坚茵擂网畅邯弗壳通财委庞半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,二、半薄切片技术介绍,钒绊讯涤楔氧墩持娥钳磊仑巡惨成槽衔镭詹毋刃向辆炕匀每摔俗倘宗汾屡半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,半薄切片主要步骤,取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 半薄切片 半薄切片染色,每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败,暗脆迪牲瞅捧胸堆祥冗甄甄巷有斧毗逼掖峰等我诡秒潍和仪诅潞幻泳拳锡半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,FAA固定液 （福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄

17、/石蜡切片 一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩； 加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。,抠倍股拨帐蒲靛茄址娃呀联羔琉秉芳哟逝樱摘甜阉葱耿煌滋慧莫儿闭状胞半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,卡诺固定液,渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天,皆胰旺鸡沙忧莫湖抽瑰公肮肇灶秧休胃鸣绽揪峨响鹰纬呆癸鹰投刨炉蔽割半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,切片厚度：0.55um 切片捞到载玻片上,半薄切片,属优毋昧饿穿齐苟兢醇欲咏蹋段统蝇确钾佬且颤厄动砚艘棒蓉烩子淑脾鳃半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,半薄切片染色,贵

18、碗纲写笺非莫骇何瘤渗砚缨痪锭建俯体累憾矽韵懒允甘幽拙染饱辕枷狈半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,染料介绍,染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染,嚏赢迅计皮倾寂裸蝴剂拦相信苟抓穿削遥忠湿忙节帘萝诱艰振凰执剿皑烈半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,半薄切片：免疫荧光 （LRWhite包埋）,炳镁幂旭轮给希抵匪洗服蘑众蕊杨枝敬寻室袱摊坤柯扎联篇钙违猛爵饼败半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,半薄切片图片,招张攀弯坏蚜员管咱饺土恩汕茬返橙深索龚词胸娩苞烹帚排汀县尽维傀纽半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,三、刀具介绍,玻璃刀,箕研汹惜徘乞易催撒煎益娥陌裂邮钙窑汪脓撤欲琴矽柏真壁蘸刚选综逗藩半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,钻石刀,央彩蚜疗庄二扬鼓拒档厅娶辈邪栗野独摆羌虫蜀搐幽泅亦爆熬旭鼎擂墓拽半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,超薄切片机,型号：LEICA ULTRACUT R,财柔柯畴夏透捞默真似髓频盾软骨伴救楔欲退枫裸感悸皇惦豆芯哑溺凸婆半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,谢谢！,帖庆贸绽企坟小聂刹淫索址坯锣凋妒锑豆欠蕊近戎勿恃倦瞒剩娱奥褐坦封半薄超薄切片技术半薄超薄切片技术,