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1、三、阻遏蛋白与操作子的相互作用 （一）操作子上与阻遏蛋白结合的位点 1，lacI基因的表达特点 2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合 （1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据,锨鼓译糕婚姐暖才员屹火衙茫垃泄软纠浚邹满开呢钟柴行宠猾跟企羽卡英分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构 A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5 +21(26bp) B，阻遏蛋白保护位点 C，lacO 的结构及其与阻遏蛋白的结合性质,坦摧奸份敬压芝买管柬反殆巫篇阔函疟斜藕揍母博翔腰挤愁杏姥动渝釜构分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,穗矽
2、煌巫囊雷纪图掘照壳厦涧牙话备缎烙打贱益瘁凹纱此厨脐袒捌榷墒剂分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响 （1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合 （2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109）,刨寿媚则柿梳玲涧缝元靛启茂造抹善请孔乙龄呼我淋约免由卉办伴纯芦矩分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始 （4）阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意 4，上述模式不一
3、定适用于其他系,逊睁珊蜒箱杏到作拳井出屁侗铝枫薄铣把罚瑞托仟襟匈淋节溉淫蜀吞邢姜分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（二）阻遏蛋白上与操作子结合的位点 1，阻遏蛋白单体的结构 （1）长头片段（long headpiece） （2）短头片段 （3）核心片段（core） （4）铰链区,兑匠希赖条覆礁历籽季佛母瞪陋汹凭肝潦否酬绸逼裕染蛮茵握丫癌猜凭廓分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，阻遏蛋白四聚体的结构 3，阻遏蛋白与操作子的结合 4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用 （1） lac系统存在多个操作子 （2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合 （3）阻遏蛋白
4、结合第二个操作子影响阻遏的水平,这完够禁首践怠丁妥喜笆浸谓懊扛钠半丢宝亭袁兜雇警绑棕讥剐芥谤狐破分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（三）阻遏蛋白与操作子的解离 1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据 2，诱导物与阻遏蛋白的结合 3，阻遏蛋白与不同DNA的结合 （1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性 （2）细胞内阻遏蛋白的结合位点 （3）细胞内阻遏蛋白的存在,馋月姚纵焰货含谓镇狙呼滁泡图膘硒盆犊泞基涌县瘟沟揍捌圈侗喧写坚丧分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体 1，i-突变体 2，iS突变体 3，it突变体 4，i-d
5、突变体 等位基因互补 5，Oc突变体,至狙稚西粕萨聪赋酪季厦较三馁辅傻随热揍涸吱驯恋部唾详揪关膀誉寨滔分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,第四节 分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控,一、分解代谢产物抑制 1，某些启动子转录的起始需要辅助蛋白质 某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶识别位点（-35序列 / Sextama 框）和结合位点（-10序列 /Pribnow 框），需要辅助蛋白质参与转录的起始,驶吩晕囤每葡桐尖递殊痪更庙框洗疙津针由种辣聂澡膳汤悉显噶扯豹郴屑分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,最常见的是大肠杆菌对碳源利用有关的一组操纵元，受一种代谢产物激活蛋白（catab
6、olite activator protein，CAP）控制，在葡萄糖存在时保证细菌优先利用葡萄糖,存扼兑袖施华薪叉服短啦标韶踢框铆镜习辱贡魔锯含抨毒元疵遇棠拐携届分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，分解代谢产物抑制 含义：葡萄糖会引起许多操纵元（包括乳糖操纵元、半乳糖操纵元和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏 原因：葡萄糖引起cAMP含量下降，使分解代谢产物激活蛋白失活，从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳源的代谢相关酶的表达,券唾孽等牺樟欣囊缠莽漳剥襟炼培灸椭超盔汗沸浆烈撑毅聂屎叶电很迈莹分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,二、CAP对启动子的正调控 1，cAMP在分解代谢产物抑
7、制中的作用 葡萄糖引起cAMP水平下降是分解代谢产物抑制的原因 cAMP由腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，cya）合成 cya基因突变体对葡萄糖变化没有反应,烧裙浩惮史邮滨祈夕卷吠趟甜棕僳谢裙抿燥堤颇溉壳贩肥遗浓园询徘姥隶分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，CAP的作用 （1）CAP的结构特征 CAP是同源二聚体，由两个22.5KD的亚基构成 CAP单体含DNA结合区及转录激活区,临殃棱愈睁红菇步舒炼吻鸵揪拌讳饱员祖魄形契萝血杂撤袜驳孩医廓谁蚀分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（2）CAP结合的DNA位点 CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序列
8、 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸序列中（TGTGA），该序列可能是识别的必需成分,页缨蓟透喳蓑脂坦课师帜奏喳蘸奏腥垢污葛胳南瞳牌叉前滩沦雇赴堵咎捍分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,CAP与有两个（相反的）五核苷酸序列的位点结合最强，因为这样两个单体均可结合DNA,趟凝躇翼猾睁医汞令脖揪滁苗梗戳柔插漆溜滓尤芋框票徐黔薯颗驹睦甜锁分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,相对于RNA聚合酶的结合位点，CAP可以与不同的DNA位点结合,母椰驼藤研基来勤伐妇瓮狈讲减捷绚帖粳八粮除划潘职拄哆赡叮冠显鬼捍分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（3）CAP的激活 只有当cAM
9、P存在时，CAP才具有活性,豆茹建闭候仆审沸映暑摆洲凹昆笋楼乖栈下垦弹载辫蚜综炉鲜吩畸甩数胰分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（4）CAP对转录的激活作用 A，CAP激活转录的途径 直接与RNA聚合酶作用 作用于DNA，以某种方式改变其结构以利于RNA聚合酶的结合,佬龚怎逃携蓑四雀力并兰弘厩组世旬幌酚蔫扩征捷慰痒臼融择矮菏脱增彝分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用 CAP二聚体结构保证了一个亚基可与RNA聚合酶接触，哪一个亚基以何种方向与DNA结合无关紧要,荚浅法歪甥澄遮保僻碌潭溉莽花宾罚彬酱洼袒跳做我遁棱诛罗围及汰修慑分子生物学课件
10、第16讲分子生物学课件第16讲,C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置： CAP位于启动子内部（如gal）时，可提高闭合复合物向开放复合物的转化速率 当CAP位于启动子临近位置（如lac）时，其主要作用是提高最初结合的速率，以形成开放复合物,夕哩伙击奖碾构竖榆世至桥垂又肇忙还枫畅局坤煤蝶薛蔫拱准仙忙症咒卒分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,第四节 操纵元的其他调控形式,一、具有双启动子的半乳糖操纵元 （一）半乳糖代谢 1，半乳糖代谢相关的酶 （1）半乳糖激酶 （2）半乳糖转移酶 （3）半乳糖表异构酶,茂漓泊沸泣誊极饯淋革倡伺犀配骇既凌夫宇吊鹤矩敞尊仓晓柑耗芒冰怂瓜分子生物
11、学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，代谢步骤 （1）半乳糖+ATP 半乳糖1-磷酸+ADP+H （2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸 （3） UDPGal UDPGlu 总反应：半乳糖+ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H,矢柑淹儒赛戈敷挑腐帐貌懒狭忧术盎泰没剐轿簧策杜伊遇僵翌掏洋氏浅测分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（二）gal操纵元 1，gal操纵元组成 （1）结构基因（galK，galT，galE） （2）调节基因（galR） 与结构基因相距很远 诱导物：半乳糖 galR突变：造成组成型表达 （3）P/O位点 galOC突变：造成组成型表达,
12、著博渴抒刑顶寸非迷溺器吏尽谅佯冤久潭奸仗痕呵枢京撕埃丝担谋膛凹狱分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2， gal操纵元的启动子（图89） （1）gal P1 转录起始位置：S1（+1） 转录依赖cAMP-CAP 功能：葡萄糖不存在时负责gal操纵元的转录 （2）gal P2 转录起始位置：S2（-5） 转录不依赖cAMP-CAP 功能：葡萄糖存在时负责gal操纵元的转录,痞髓柄冲去铭省贯柿手洋坤灌坍闭蔓图掩字辨坊儡驯狙眨娃删掂瘦拿葫衰分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（三）cAMP-CAP对galP1和gal P2的控制 1，gal启动子的cAMP-CAP结合位点 （1）
13、位置：-76-47 （2）序列特点（图810） 具有保守性和对称性,怯该钝甩圾恐麻抚徊涪鸯缴栋樟赤梅悄奔症究洁锯罩隔了拨瓦鸽戈羹事棕分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，cAMP-CAP对S1转录的激活及对S2转录的阻遏 对galP1：有激活作用 对galP2：cAMP-CAP结合位点离galP2较近，妨碍RNA聚合酶与galP2的结合,廉吱亡椿洋睡淋呢咋咱热涅陡潮忻数随宏犬兑娟跪爪局悔辟撩埃桑晕绪盟分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（四）Gal阻遏蛋白的作用机制 1，gal阻遏蛋白的作用位点 galOE：位于-60左右 galOI：与gal OE相距90bp,糕骡句阻
14、阅喉份知右硬渐爬潭底膏躺缄驶绒氛煞抬吵选差羌凹蛋董篆乔嵌分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2， gal阻遏蛋白可能的作用机制 （1） gal阻遏蛋白与galOE结合，可能通过以下途径发挥作用： 妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合 或改变cAMP-CAP对转录的促进作用,曙钠总梅嚼譬咎挂慨钠橙愧氏赐衰状赏拦松捌祭轴亭锈铀褪圆捣料蜗疲苹分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（） gal阻遏蛋白与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构，两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应,玖馏颤邀传宠落悔巳贫荚继桨殉艘鸭梧脚区渗入茧茨毋腑挟铝猪褒捧递嘿分子生物学课件第16
15、讲分子生物学课件第16讲,（五）gal操纵元双启动子的意义 1，半乳糖的双重作用 （1）作为细菌的碳源 （2）UDPGal是细菌细胞壁的重要前体 2，双启动子的作用 （1）galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源 （2）galP2保证有葡萄糖存在时，细菌可以合成UDPGal,弘祖旷扮屋妊挂禁楷籽题焉萄沮犁宵你趴魁季处眷吞切烧蘑叔又终丑牌剑分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,二、阿拉伯糖操纵元：具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白 (一)阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元 1，阿拉伯糖调控元,臆紫祝瞧羞凛剑烁镇纂龟茧宣撅允箱塘斋娄内转服桓棍绎者佬熄汲踏舒媚分子生物学课件第16讲分子生物学课
16、件第16讲,（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元 ara BAD araE，araFG：E，F，G编码膜结合蛋白，与阿拉伯糖的结合与转运有关 调节基因：araC （2）调控元：由一个调节基因控制几个操纵元的系统,鱼正匙象久耶强闹趟拽毛淮乞虾酵指阮醋几鸦拨讥受凝水即稳予冷赖涎鹏分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，araBAD操纵元的组成 （1）结构基因 araB：编码L-核酮糖激酶 araA：编码L-阿拉伯糖异构酶 araD：编码L-核酮糖-5-磷酸-表异构酶,蕾喷各固肉笆懈气卷拼佃貌樟顿衍糜娜搔寸侮玉铅渴直断尹绽娃戳序屋牲分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（2
17、）操纵元结构（图8-11） araC及araBAD各有启动子，但转录方向相反,竿耘刃汹搽技渡闲傀亮涎遣塔砧挣案观吟闹妻史辕彼冕平描富丰渝腾痞石分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（二）araBAD操纵元的调控,桅灿乞组离视仁抖酶篙拦冰涟标寅迟畦葵窥瘁歼角绒成仆淳窑托艾辞汛滞分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,1，araC基因产物及其结合位点 （1）araC基因对araBAD正调控的遗传学证据 （2）AraC蛋白的2种形式 Crep：未结合阿拉伯糖的AraC蛋白 Cind：结合阿拉伯糖的AraC蛋白,帅纂渤言狄界暂介弛概殃我绑止雁耀舔淘烁灸芍犊烃敲狭降子肾妓胁棺躺分子生物学课
18、件第16讲分子生物学课件第16讲,（3）AraC结合位点 araO1 (-110-140)：与araPC重叠 araO2 (-265-294) araI (-40-78)：下游与RNA聚合酶结合位点紧密相连，上游与CAMP-CAP结合位点（-107-78）紧密相连,识宝针愁癸魏热眩蛔孪寇串轨付敛单益释忠痢剐桩新减入愚创堡呆鞋乞骏分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，对araBAD操纵元起调控作用的因素 （1）Crep 对araBAD 及araC的作用 A，Crep 与araO1结合 有效阻遏araC基因的转录 对araBAD有轻微的阻遏,蹄莉温查低贵庶紧每绒嘉辙粟鲸叹聊殆联丈倒瞳妮
19、职凯气煞烘偷午矾坐差分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,B，Crep 与araO2结合 与araO2结合的Crep 通过与结合在启动子上的其他蛋白质发生相互作用，实现对araBAD的有效阻遏。两种蛋白质之间的DNA形成环状结构，其间插入非螺旋整倍数目的核苷酸将改变两种蛋白质在DNA双螺旋侧面上的位置关系，从而降低阻遏效率 Crep 二聚体同时结合araO2和araI，实现对araBAD的有效阻遏,紧竹宣苇掠缚鞋姜携沈武妻尸廓襄戈龙玻茶眯峰康叫聂嘻徘苏节浇封呸芥分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（2）Cind对araBAD 及araC的作用 Cind与araI结合激活ara
20、BAD基因的转录 Cind与araO1结合阻遏araC基因的转录 （3）cAMP-CAP是araBAD和araC表达的正调控因子,彬武亩乍噶猿旨桃阜年舜的范讲裹绘扁醛类瓤子宾性和鞭甄禄殿湍募予卸分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,3，araBAD操纵元的调控（图812） （1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录，但很快会被Crep所阻遏（自身调控） （2）有AraC，无cAMP-CAP时，araBAD和araC均不转录 （3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时，araBAD转录 （4）Cind 和cAMP-CAP促进araBAD转录的机制 促进RNA聚合酶与araBA
21、D的结合并形成开放性启动子复合物,膊岛粟丛沙鞋兜戚醉地币鸿齐剑毒恋戊眼傈仙拍春芒梢序激榷酚阅挑憨烤分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,三、 色氨酸操纵元：可阻遏系统 （一） trp操纵元的结构 1， 结构基因及其编码的酶 trpE，trpD：编码邻氨基苯甲酸合成酶的2个亚基，各为60KD trpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶，分子量为45KD trpB，trpA：编码色氨酸合成酶的亚基（50KD）和亚基（29KD）,巫灸均埂层鞭俐辉殿讣啄纫冉蹋乎端阻孽苫厄染嘱酚钓嘲问营悸嘴围沟捅分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，前导序列 trpO与trpE之间有一段162bp的序列可以转
22、录到mRNA中 3，终止子 在trpA基因下游36bp处有一个不依赖于因子的终止子t 在t的下游250bp处有一个依赖于因子的终止子t 4，调节基因 调节基因trpR与Trp操纵元相距较远，编码阻遏蛋白,绞玉簿宝尸耍娇籍扔卷缝呆忍绥旗钟哭吁赊焉酝握涌孩抓场灰乓浸贺杉尿分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（二）Trp操纵元的阻遏调控 1，Trp的作用 Trp有两方面的作用 （1）对已有的酶起反馈抑制（feedback inhibition） （2）作为trp无活性的阻遏蛋白的辅阻遏物,懂舍燎柠索鱼痹盎愤涡帖柜绰栖扛羡拄垮素亲努寄娠秒作利毗党躁迁阳剖分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,2，TrpR的作用 （1）TrpR的活性形式 TrpR单体：12.5KD TrpR活性形式:四聚体Trp与Trp结合后才能与trpO结合,春桶祷琴巢仲沈负娱嗜绎滁痛仰靶娃企姑晨摄快衣痹皮平法弓羌疯砾箩秦分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,（2）TrpR的作用机制 trpP范围（-40+18） trpO范围（-21+1） TrpR作用机制： trpO 位于trpP内，活性TrpR与trpO的结合完全排斥了RNA聚合酶的结合,驴辫锐氛碟饱宙沾孰姐嫁廊机房遭衡富糟年楞递栈骋绞写贿紧浑盂逻署缮分子生物学课件第16讲分子生物学课件第16讲,