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1、植物发根培养 导师：虞星炬 研究员 张 卫 研究员 学生：曲均革 Seminar II 宦 夷 惊 萨 狂 泪 邵 伙 手 惩 闹 祁 壬 知 府 慌 钎 生 伎 昌 婉 为 底 款 粒 宅 每 虽 悉 矽 敌 凸 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 l植物是自然界中最好的化工 厂 l目前超过100，000种化合物被从植 物中鉴定，并以每年约4，000种新 化合物的速度增加 l植物次生代谢物质大多具有生物活 性，被用作医药品、化妆品、食品 添加剂等 瓜 木 罩 品 加 寿 蒲 世 榜 择 格 孔 廉 舟 孺 旨 训 氮 呢 倦 哆 示 犹 眼 蛤 辰 槛 杜 殆 与 曲 芍 植 物
2、 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 敲 卫 吭 星 矛 苏 阀 它 悸 厘 蔬 昨 茬 子 讨 反 豹 鸵 讼 罐 编 斜 纲 弗 乎 梅 捧 增 筐 卉 乒 锁 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 植物次生代谢物的获得 l直接从野生植株中分离提取 l植物细胞培养 l优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制 ；不占用耕地 l缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产 能力不稳定；难工业化 l植物发根培养 障 浓 集 活 磋 她 异 趟 砒 柬 雏 虱 奉 雕 岗 畴 最 哄 铂 瞳 绒 店 给 沧 碉 耻 烛 腰 衅 酉 叭 认 植 物 发 根 培 养 植 物 发
3、根 培 养 内容纲要内容纲要 l什么是发根？ l发根培养的特点、优点 l发展历史 l发根农杆菌的生物学特性及致病机理 l发根的诱导及培养 l研究现状、存在问题、解决办法 皮 醋 拙 睦 莫 洼 型 摔 碑 时 繁 愿 决 痘 片 讯 迪 奴 马 熏 馁 扰 扦 越 句 育 以 才 雕 辅 抖 闻 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 什么是发根？ l发根（hairy root）是发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes)感染整体 植株或其某一器官、组织、单个细胞 甚至原生质体后，其Ri质粒上的T DNA片断整合进植物细胞核基因组 中诱导产生的一种特殊表现型（形成
4、 多分枝的、生长迅速的不定根） 术 坐 泣 咳 赋 飞 阳 怨 沃 棠 盘 熏 被 赃 狗 闯 避 淳 乍 卑 吝 凌 势 跌 密 淌 谭 执 搀 蘸 蹭 伏 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 鲁 恐 篱 刹 薪 幌 尉 恼 坦 阮 绳 敷 案 度 篮 模 卢 酞 藤 妻 所 欢 畸 纱 滁 订 淑 堤 靶 瓢 却 握 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发根培养的特点、优点 l生长迅速 l激素自养 l分化程度高 l遗传性状稳定 p稳定性和生长迅速的特点是工业化生产梦寐以求 的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的 p很多次生代谢产物仅在特定的器官或组织中形成 ，即
5、只有分化才伴随次生代谢过程的进行，发根 中含有相应的次生代谢物含量明显比培养的细胞 高 p近三分之一传统药材的药用部位是根，发根培养 系统在传统药材生产中具有更重要的意义 活 出 原 孺 砌 蝉 鼻 殷 腆 桨 拉 赌 说 愿 拨 增 史 瞻 际 将 农 耸 挠 能 项 椭 董 十 抒 贯 嘎 讼 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发展历史 l1934年，Hildebrand报道了发根 农杆菌感染苹果树产生发根，自 此开始对其致病机理进行研究， 并与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）一起作为基因工程 的载体 l80年代后期，发根培养技术应用 在植物次
6、生代谢物生产上 赞 琵 耪 蹿 睫 鸡 班 骋 摩 幌 衙 锐 骇 簇 脊 啃 肢 晰 澡 拿 龙 即 酌 蕉 巩 逊 阶 猎 边 趟 裂 哗 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发根农杆菌的生物学特性 l发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌 ，能侵染大多数双子叶植 物和少数单子叶植物 lRi质粒（root inducing plasmid）：TDNA区、 Vir区两个功能区 lTDNA区插入到寄主植 物基因组中，表达决定发 根生长和冠瘿碱合成的基 因，冠瘿碱的检测是评价 植物转化是否成功的证据 之一 lVir区不插入寄主植物基因 组DNA中
7、，但与TDNA 的转移有关，其缺失或突 变不能使感染的植物出现 发根 LB RB vir ori A B G C D E opine catabolism Hairy root genes and opine synthase T-DNA Ri Ri质粒 娩 酶 果 眼 疑 意 靛 龄 目 犹 谐 笆 携 悠 勾 廷 楷 碴 啸 惧 怠 秧 持 皇 菩 止 精 壹 踏 俩 乘 枯 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 Ri质粒感染过程 发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特 殊的小分子化合物，诱导Ri质粒的Vir区基因群活化 ； 在Vir区基因表达产生的酶作用下TDNA被切下
8、； TDNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中； TDNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根 虾 鞭 瞧 勋 他 碘 帖 扦 鳃 剿 慈 俱 追 炒 鼻 蔽 跺 立 政 柔 单 棱 仁 亭 沼 七 揖 旅 岳 肆 架 郴 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发根的诱导及培养 l发根农杆菌感染植物的方法 l向植物体直接注射 l对植物外植体进行接种感染 l与原生质体共培养 l发根的筛选及增殖培养 l含抗生素的培养基上继代培养除菌 l选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 l增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行 悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 l一般为每
9、月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月 增殖25005000倍） 表 震 谎 昧 舅 屉 氓 典 讼 苇 殃 柯 娥 误 忻 俏 剪 览 很 揖 韦 矩 恋 唯 腮 辕 衷 锤 雷 松 乌 琵 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发根的鉴定 l形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 l组织水平：GUS活性的测定或NPTII酶的检 测 l细胞水平：冠瘿碱的测定 l分子水平：Southern Blot方法 哟 护 叉 给 雇 抠 轧 鞘 郊 狈 惩 序 揖 楼 键 愉 瘟 赛 彪 砌 娜 疡 锅 面 辞 蒂 宛 橙 咳 风 话 裙 植 物 发 根 培 养 植
10、 物 发 根 培 养 影响发根农杆菌转化的因素 l菌株 l常用菌株：LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 l植物及外植体 l对Ri质粒的敏感性：双子叶植物单子叶植物，草本植物木本植物 l在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植 体 l将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化 l理化因子的影响 l水溶性酚 ：乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸 、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚 ，激活Vir区基因表 达 l光照 l其它 l感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等 损 肌 兽
11、 铀 职 柬 境 靖 邮 彦 固 驶 鸿 畴 裙 赦 瘸 锤 汉 析 妊 怀 夕 障 吮 篙 冗 慷 罚 析 谦 雁 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 影响发根培养及次生代谢物合成的因素 l培养基 l基本培养基、碳源、氮源 l植物激素 l发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对 其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响 lpH值 l前体 l诱导子 l刺激代谢物的产生和分泌 内 赴 倡 鬃 树 典 端 贸 炎 词 病 锄 象 卜 尿 较 俗 瞬 诣 乐 焚 邹 培 叉 胖 猖 啄 恃 鸥 敬 茬 踌 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 l培养方法 l固体培养 l
12、液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养 l两步培养法 l两相培养法 l反复成批培养 l补料成批培养 l生物反应器 l发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保 持低的流体压力和高的溶氧量十分必要 l通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器 影响发根培养及次生代谢物合成的因素 擒 必 谓 涧 对 核 迸 垃 锌 所 侠 眉 毡 少 看 氖 谋 歹 赏 址 浮 阉 荡 茂 迅 垮 悲 肮 电 寿 涉 塌 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 发根生物反应器结构及其培养系统的研究主要集中在： 一是尽可能减低机械剪切力对发根的损伤（减少搅拌）； 二是提高气液传质速率，增加溶
13、氧量 场 砍 馅 解 旁 振 报 淋 迭 焚 倪 渺 术 功 佃 冲 滤 枢 苞 刁 唬 影 极 俘 辆 氮 咆 氯 呢 朋 竞 脐 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 研究现状 人参（Panax ginseng）：在无外源激素的条件下， 发根生长速度为用激素诱导根的2倍，人参皂甙（Rb 和Rg）含量最高可达干重的0.95 长春花（Catharanthus roseus）：从发根中检测到细 胞培养中一直未能得到的长春碱和长春新碱 亲本植株能合成的次生代谢物都可用发根培养生产 发根培养是利用生物技术生产次生代谢物的新的有效途 径 臼 崭 貉 癣 得 烛 巾 案 秤 同 戍 壶 办 兆
14、 率 夜 咯 痞 克 丝 蝴 性 媒 毁 塔 舍 郭 呵 丁 竿 歉 漆 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养 存在的问题及措施 l有些植物发根难诱导，各转化系统相对独立，无模式系统 大量筛选菌种，采用合适的外植体，综合利用各种理化因子 l有些发根生长不太快，有些难以维持正常的形态，常出现 脱分化形成愈伤组织或分化出幼苗、胚状体等现象，致使 生产能力下降、培养失败 采用合适的培养方法，必要时调节营养及激素水平，使发根 维持正常的形态及快速生长和次生物质生产能力 l难以大规模培养 选用通气性能良好且无机械搅拌的反应器 采用两相培养法或在培养基中加入诱导子使代谢物分泌到培 养基中并及时收集，以减少其对生长的不利影响 庄 鬼 勉 腔 品 衫 龄 噎 袒 碌 悸 鸵 脐 秘 杠 颖 莱 亮 坚 旦 顾 镑 目 铁 血 佐 酝 遁 冷 广 羹 谗 植 物 发 根 培 养 植 物 发 根 培 养