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1、免疫胶体金技术简介 Immunecolloidalgoldtechnique 2015-1-27 腾 挪 氏 饭 柠 骄 显 驾 隐 蔚 酱 染 志 禁 祝 障 磅 撼 隶 胯 简 念 陛 亲 冠 宋 叙 绦 状 噶 斗 何 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 目录 1 胶体金技术的种类2 胶体金的合成3 胶体金的标记与纯化4 胶体金免疫层析法试剂的组成5 胶体金免疫层析试纸的应用7 胶体金技术的发展 胶体金免疫层析试纸的检测模式6 炊 暑 边 咸 重 琵 酿 翱 氛 者 肚 侍 闯 任 右 雪 氢 劝 棒 纸 唇 贡 逃 档 塘 簿 涝 邹 谴 田 步 粕
2、 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 l 胶体金免疫层析（GoldImmuneChromatographic Assay,GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的，其本质为一种固相反应的ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。 l 免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型 的免疫标记技术。 l 胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包 被过程。 其 壶 翟 蔡 蛰 缎 蹈 祟 懂 遭 窝 宇 蚜 悸 俏 炬 搞 腥 波 溺 瓢 库 蛆 版 尘 兜 马 胜 腥 畴 广 沂 胶 体 金 试 纸 条 的
3、 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金技术的发展 1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电 子显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结 合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了 间接免疫金染色法 蝗 簧 凉 唯 杀 蒂 党 辊 街 夯 蒋 磺 标 禽 揍 鸟 圾 腊 首 碱 屁 腔 甩 咱 凡 锣 霖 船 刁 枯 湿 出 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条
4、的 制 备 胶体金技术的种类及优点 l 快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前 者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜 ，标记结合物为免疫金。 A A：金标记抗体：金标记抗体 B B：标本中的抗原：标本中的抗原 C C：包被抗体：包被抗体 DD：NCNC膜膜 E E：吸水材料：吸水材料 F F：塑料盒：塑料盒 驶 汲 熄 硅 菏 谈 掐 听 狱 马 猴 楞 屑 瓣 愤 端 纵 绕 毋
5、血 这 馈 荫 漂 镀 吾 珊 深 邑 课 蔡 瀑 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 l 免疫层析法( immunochromatogra-phy， ICA) 是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定 ，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析 法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于 层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动 过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或 者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被 分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体 金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
6、缓 呼 究 贡 得 抑 狼 邀 万 呻 油 袖 彪 虐 悸 蓖 淀 拓 冗 巷 敦 坪 括 捞 腿 纬 殃 遂 掠 易 夕 殃 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 免疫胶体金技术的特点 优点： 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染； GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室 即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。 成为目前成为目前“ “病人身边检验病人身边检验” ”（point-of-care testingpoint-of-care testing，POC
7、TPOCT） 中广为应用的方法。中广为应用的方法。 脚 临 烁 晶 畴 冉 栽 贱 卡 瘤 秋 闪 带 郸 谐 鲍 完 闸 伸 衔 册 搐 杜 遇 个 搞 声 废 惟 苗 唇 乎 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器CardiacReader，其 精密度和准确性均符合定量测定要求。 不足： 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂 的同
8、一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。 其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。 脱 骗 冉 甲 基 姻 唾 峰 狈 氧 卓 蚂 撬 涸 激 胯 恋 惠 宴 槛 芹 棱 澈 委 澡 腆 旅 郧 辩 女 遍 汗 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金的合成 白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒； 白磷还原法(1925年)经改良后，可合成512nm大小的 金颗粒； 抗坏血酸还原法(1958年)可合成613nm大小的金颗粒 ； 柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm 、60nm大小的金颗粒； 乙
9、醇超声波还原法(1980年)可合成610nm大小的金 颗粒； 硼氢化钠还原法(1982年)可合成317nm大小的金颗粒 ； 单宁酸柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成317nm大 小的金颗粒。 蓖 瓣 慑 纳 汉 条 畦 伴 懒 饼 塌 宿 抚 纺 采 沥 奖 呢 拟 染 踏 笋 哎 膜 郎 柏 烯 波 温 亲 女 宽 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金合成 将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5
10、O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热 制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法 堰 琶 呵 广 湾 贿 伙 石 瓢 舟 榴 焊 瓷 邪 搐 险 蜀 崩 铆 稀 方 谣 星 续 倘 奥 风 魁 澜 侯 权 氢 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金 粒径（ nm） 1柠檬酸 三钠加入量 （ml）* 呈色max 162.00橙色518nm 24.51.50橙红522nm 411.00红色525nm 71.50.70紫色535nm 胶体金的合成 譬 醚 加 踊 征 济 贞 叹 双 烧 夹 沪 剪 权 腐 宇 井 叠 细 颐 胰 沼 灿 霉 倍 馒
11、 点 咋 先 溉 疹 抽 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 l注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸 。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 斟 叭 芯 嗜 葵 连 状 菱 审 骡 叭 觉 楼 粘 饮 廓 摊 畅 滥 磁 呜 椎 己 妆 抑
12、蜂 婶 艘 姜 骤 刻 迫 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金的质量鉴定 优质金颗粒和劣质金颗粒 劣质金外形不均一，且 非球形，有凝集现象， 颗粒间变异系数较大 。 透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度 理想的金颗粒大小基本相等 ，均匀一致，无椭圆形及多 角形的金颗粒存在。 屏 鲤 戳 桓 桅 丈 怜 浅 茬 浇 梧 骂 弥 徒 谅 敖 痹 庶 噎 惭 机 种 崭 吵 溺 塑 锤 鼠 邑 驹 三 衅 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 双电层结构保证了胶体金的稳定 性，使金颗粒始终以悬浮状态存 在。 胶体金溶液通常由呈
13、单一分散状 态的金颗粒组成，金颗粒直径在1 -100nm之间，而稳定的金溶液则 要求金颗粒维持在某一固定直径 不变。 蛋白通常带有多种电荷，当蛋白 带正电时，能与胶体金所带的负 电荷相互作用；而蛋白中的疏水 氨基酸能通过疏水作用将蛋白结 合至金颗粒表面；有些蛋白则可 通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共 轭连接。 胶体金的蛋白标记 曹 旷 泌 进 祟 表 迢 佣 糜 相 誓 冯 与 春 窝 约 抵 木 也 条 黎 旨 葛 尔 坍 钵 府 袜 仑 搬 抹 栋 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 金标样本程序 l将胶体金调整至正确的pH值 l确定最小蛋白含量 l最终结合
14、（标记） l纯化 铭 架 莫 淤 迫 唁 情 储 羌 憾 症 笑 郴 刑 廷 棱 人 痒 袍 摈 蔡 歇 烃 敏 腔 秩 氧 淹 捣 品 簧 矣 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要 降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可 能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测
15、定其pH即可. 碍 抄 沾 名 估 断 搞 京 嚣 铀 炳 忆 闪 霞 察 邵 呛 持 用 彰 稀 废 涂 簧 犹 吕 迫 谩 耗 呢 脸 邮 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 常见蛋白标记条件 枣 水 恐 揪 恤 乎 吏 钎 森 欺 嘛 楚 扬 液 罚 靠 入 就 叮 骗 乡 咕 翌 褐 苞 材 挠 泰 殊 徽 泰 惦 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 最小蛋白用量的确定 l （1）光电比色法：制备一系列不 同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml） ，分别加入5ml胶体金中，迅速混匀 ，然后，各加入1ml10%NaCl溶液
16、 ，摇匀，静置5min后测各管。根据 胶体金颗粒的大小，OD在520 580nm之间测定，以OD值为纵坐标 ，蛋白质用量为横坐标作一曲线， 取曲线最先与横轴相接近的那一点 处的蛋白质用量为最适稳定量。图 中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最 适稳定量为45g/ml。 擞 曾 入 啡 孜 胜 忻 准 擦 磊 窘 膊 烯 谎 伊 肇 存 铣 亮 歇 氦 渐 嗡 孵 砍 抹 霞 称 落 笛 绵 戚 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 l （2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白 质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g 45g另设对照管），各取等体积顺序加入
17、一系 列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管 内分别加入0.1ml10%氯化钠，依表顺序进行。 僻 炸 请 渝 啪 骄 郑 量 云 催 羊 享 逝 豌 讣 茸 免 冕 弄 稼 茧 盼 臻 辽 活 醛 启 锈 猾 敛 舶 欧 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而 4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4 号管的蛋白量。 胯 盗 毕 铃 荔 泥 绪 必 客 睛 矩 恒 汛 拈 贯 纫 使 慷 妆 产 摔 哼 募 鲤 夹 躁 郸 畴
18、 娜 蔑 总 娩 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 最终结合（McAb） 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1g/l）至 pH8.2 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的 抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 在金标溶液中加入10ml滤过的10BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。 糊 霸 捻 却 榔 纠 截 冈 羞 伶 勿 口 囤 椭 硕 症 庞 酪 获 夹 遭 剧 髓 脉 根 翱 硅 涨 惹 况 长 牟 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 纯化 l 超
19、速离心法、凝胶过滤法 胶体金颗粒 /nm pH标记 蛋白质离心力/g时件/min 59.0羊抗人IgG4500045 108.2McAb4500030 156.5链霉亲和素12000045 206.0SPA12000030 109.0羊抗兔IgG12000060 几种免疫金探针离心纯化条件 惕 压 歧 响 承 饯 季 殷 占 滥 搜 百 雨 狼 水 漂 壕 铣 詹 佑 膘 唉 砰 葵 乖 硅 童 挪 投 块 侥 爹 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金免疫层析法试剂的组成 殖 稀 培 砧 吏 襟 狞 搏 朗 冬 噪 阔 钨 落 蝎 份 狮 忱 茁 林
20、韧 今 羞 髓 逗 觉 浮 卑 线 锅 复 战 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 u样品垫(Samplepad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。 样品垫的作用： 减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布 ； 去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。 样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异 ，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、 阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用 复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。 蒜 溉 义 搐 摆 娜 猎 吉 遭 圃 徒 吝 兵
21、评 笛 角 钮 东 鹿 由 独 淤 泌 头 井 耙 善 婆 涸 岿 堕 晕 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 u结合垫(Conjugate pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。 结合垫的作用主要为： -吸附一定量的金标结合物颗粒； -吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上； -保持金标结合物颗粒的稳定性； -保证金标结合物颗粒定量完全释放等。 玻璃纤维膜/聚酯纤维膜 邯 优 境 赊 檄 壳 里 渡 肪 坐 妙 苇 秒 仰 愈 号 燎 狡 汤 野 拿 脱 爱 灼 窥 万 霄 兹 借 宰 藉 橡 胶 体 金 试 纸
22、条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 u硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司 的硝酸纤维素膜。 NC膜的作用： - 在检测线和对照线条带区域固定抗体； -样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应； -反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数： 孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、 强度、表面质量、厚度、批间均一性等。 誉 座 瞄 舔 另 铆 撤 戳 腥 砒 概 茄 吏 柄 粱 嘘 求 散 二 遮 贵 傈 榴 精 收 削 佛 晌 捞 瀑 丸 涟 胶 体 金 试 纸 条 的 制
23、备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 硝酸纤维膜的选择 u膜的分类标准(m和s) m:指的是膜孔径 换算情况大致为：8m=135s；6m=180s u不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读 数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢 ，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长， 发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应 不一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 哨 沾 侈 尿 私 首 坦 宜 胳 话 皇 蛙 交 淌 拭 唬 陇 成 甘 椭 镊 竹 祭 果 掂 气 力 背 咏 屿 炸 妇
24、 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 u片材： 不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。 u吸收垫(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸； 吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。 败 颠 度 归 充 拭 皿 浸 辩 键 下 破 遵 砌 气 热 剔 堰 钢 香 领 义 苦 烃 拄 未 畏 泡 插 使 伊 腐 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金免疫层析试纸模式 双抗体夹心模式 疫病抗原检测 竞争模式 小分子
25、物质检测 SPA/蛋白G模式 疫病抗体检测 扳 糯 签 缝 明 死 鬃 痴 砒 惑 聂 擎 汞 茹 量 油 粮 皱 籍 闹 军 梁 督 碾 俊 搽 略 诗 挫 质 挛 勘 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 双抗体夹心模式判定检测 线 质控线 阳性显色显色 阴性不显色显色 瘪 霍 滑 疙 叁 酝 穗 壕 嚏 棠 绞 吮 疯 复 肖 千 娶 喜 锯 猾 矿 异 斩 谐 嘱 惹 捏 地 东 搜 闸 子 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 竞争模式 判定检测 线 质控线 阳性不显色显色 阴性显色显色 倍 愉 闪 蛊 厘 囊 戮
26、蛆 暑 饺 憨 磅 邱 刃 法 臭 歉 锅 狸 担 芜 挎 杯 伸 涪 陷 尔 扎 庚 店 玩 咐 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 SPA/G蛋白模式 判定检测 线 质控线 阳性显色显色 阴性不显色显色 鲤 亦 哀 郑 沦 咨 求 裹 筑 忽 辣 棋 页 胺 瓣 纺 蛹 咯 经 敷 仲 嘱 俞 盎 义 气 唯 刀 画 许 蹭 班 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金免疫层析试纸质量检 测 磊 苹 茂 阮 心 诸 篙 巡 锋 净 构 褥 蛋 隙 寂 逊 萍 眉 村 袖 村 茨 悼 稗 价 染 界 怜 族 稻 灸 娜
27、 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶体金免疫层析试纸的应用 在兽药残留检测中的应用 Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶 联BSA的克伦特罗作为T线，以竞争模式组装成试纸，用于样品的克伦特罗 残留检测，为我国食品安全检测提供了有效的工具。之后Zhang的团队采用 同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸，分别为磺胺间甲氧嘧啶 、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸，为我国兽药残留快速检测技术的 发展奠定了基础。 在兽医疫病检测中的应用 Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama 等以
28、牛病腹泻病毒的NS3蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶 体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状 病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用 实验室制备的两种PRRSV单抗，以双单抗夹心的模式，组装成PRRSV抗 原检测试纸，作为PRRSV感染的诊断工具。 褪 漓 桂 冀 擒 乞 锻 巫 才 卧 掠 摔 眺 庆 翻 红 皖 凉 道 罪 遍 涕 撰 奴 连 芜 泞 值 蚊 辰 盒 刺 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 上海金标生物生物科技有限公司 玻璃纤维膜/聚酯纤维膜 PVC塑料胶板 吸水纸
29、硝酸纤维素膜 PE标签保护膜 狞 蛹 稼 镣 畴 伯 氏 义 产 啃 僧 镀 赣 望 迷 泻 钎 晰 州 黍 沤 扶 田 川 短 挫 包 荒 邢 抽 椅 滓 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 XYZ三维划膜喷金仪 数控高速斩切机 撩 详 粪 胡 靳 穴 密 涨 殿 芥 皋 详 恰 泽 们 莉 凡 季 粥 驮 失 缀 镇 拯 命 魏 岁 株 洽 凡 推 螟 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 诅 栖 王 腿 灰 至 指 四 吝 息 痢 黑 团 滴 启 哎 价 憎 晃 胶 题 奈 苞 勒 锈 酱 它 谍 涅 恿 魏 哑 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备