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1、化妆品检验中心 体外评价体系简介 躇 荒 涅 兑 室 陌 辆 镑 栏 叁 鸳 刘 丹 兴 摸 缀 挺 屋 耽 邵 征 各 妊 悼 蜘 货 淄 取 呐 何 淬 鞭 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 体外评价 体外评价是指在活生物体之外的环境中利用细胞、模拟活生物体 模型等平台进行的评价。 在生物评价领域中，体外评价具有以下方面的特点 1、符合“3Rs”原则（Reduction，Refinement、Replacement） 2、检测结果的稳定性好、再现性高 3、可为临床评价提供有效的技术支持 哦 烂 泼 吓 叁 病 乙 痕 酉 闷 泰 环 络 垫 伟 亩 以 颗 酬
2、 钨 货 弧 邻 迭 窜 芹 篙 质 毡 造 攻 伤 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 体外评价体系的构成 评价项目的确立 1 评价内容的分析 2 评价方案的建立 3 最佳评价平台及方法的筛选 4 安全性评价 5 功效性评价 6 评价结果 7 蔑 稻 掉 墨 汪 稠 谢 叙 劝 痊 求 岸 蛆 瘤 饮 靖 猴 馁 妙 讯 赐 岳 女 蛇 咖 甫 列 盂 氧 坛 邻 硅 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 安全性评价项目 1、刺激性评价 作为动物刺激性实验的代替法，使用 3T3细胞分析评价被检物质的毒性指标。 兔角膜细胞SIRC 2、眼粘
3、膜刺激性评价 向兔角膜细胞SIRC 添加被检物质，确 认刺激性效果，再与标准品对比进行刺激性 强度的评价 3、细胞毒性评价 向细胞添加被检物质，确认其对细胞的 损伤情况，判断其毒性作用。 鸟 琵 纬 鹃 脚 蔼 粥 怂 奸 烹 尉 需 拄 沃 窜 舷 腑 锈 容 颖 躺 踏 瞄 莎 购 余 乘 按 标 濒 岭 殊 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 4、光毒性评价（UV照射） 对经过被检物质处理过的BALB/c 3T3小鼠成纤维细胞进行 UVA照射后，以细胞摄取中性红为指标测算出细胞存活率，确定 50%细胞毒性的被检物质浓度（TC50）。 通过UVA（+）、UVA（
4、-）照射时的TC50应用下列公式计算出 PIF值（Photo Irritant Factor）、MPE值可对被检物质的光毒 性潜能进行评价。可以对单一成分和成品进行评价。 UVA ( -) UVA (+) 样品浓度增加 细胞生存率降低妊 语 引 燕 衣 晨 情 徊 冠 斤 为 黎 促 暑 取 亡 危 聋 屿 环 莱 袖 踞 裙 酿 暑 令 招 超 坦 剑 豺 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 1、抗氧化应激作用评价 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指破坏了强氧化剂和抗氧化 剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的 主要原因
5、。 皮肤作为机体最外层的保护层，不可避免的受到紫外线与刺激物的 作用，使皮肤细胞内的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS ）过 多增加，诱发氧化 应激作用，成为引起人体细胞老化的潜在因素。 功效性评价项目 人体皮肤细胞中氧化应激作用的形成原因 紫外线照射（UVA、UVB） 过多活性氧的累计（ OH 、O2- 、H2O2、1O2 ） 过氧化脂质（氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物 ） 缺 浦 骄 簧 吉 勒 汇 可 酌 奸 谨 蛮 厨 议 长 耘 跌 闯 单 圆 贫 睦 滥 概 袒 壶 碳 尼 腾 们 烈 交 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系
6、介 绍 抗氧化应激作用的评价 评价方法： 对细胞进行氧化应激刺激，添加被检物质，通过对细胞生存率 的分析来评估被检物质对氧化应激作用的预防与治疗作用。 评价项目： 评价消除由下列因素诱发的氧化应激作用的效果 UVA、UVB照射 抗活性氧（ OH 、O2- 、H2O2、1O2 ） 过氧化脂质 评价平台： 正常人体表皮角质形成细胞 正常人体皮肤成纤维细胞 被检物质添加时间点： 氧化应激刺激前 氧化应激刺激中 氧化应激刺激后角质形成细胞成纤维细胞 罚 烂 却 践 颅 脯 拉 陪 掏 岔 锡 损 狼 醚 蒲 停 拥 的 逐 涎 拙 伦 称 鹤 抽 他 乱 拇 阶 詹 剃 菌 体 外 评 价 体 系 介
7、 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 2、抗衰老作用评价 皮肤的衰老通常分为内在性老化和外源性老化。 内在性老化见于暴露和非暴露部位，明显的特征为皱纹和皮肤松弛 ，表现为表皮、真皮变薄，表皮真皮连接处变平、弹性纤维和胶原纤维 减少等情况。外源性老化主要发生在皮肤内在性老化的基础上，常由紫 外线等引起，见于面部、颈脖和前臂等光暴露部位，表现为粗深的皱纹 、异常的色素沉着、毛细血管扩张等。 抗衰老是国内外美容皮肤病学研究的热门主题，对于抗衰老作用的 评价，本实验室采用国际通用综合评价模式（体外评价+人体评价）。在 体外对被检物质的抗衰老效果进行评价，取得的评估结果可为人体评价 提供参考依据。 评价
8、平台： 正常人体表皮角质形成细胞 正常人体皮肤成纤维细胞 化学反应检测 坎 钩 庄 误 擞 焉 墨 微 钓 领 嘘 泼 所 泵 淤 谐 盅 孵 定 趋 绊 基 拴 朔 续 膘 街 蒂 闰 膜 蹬 专 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 促进胶原蛋白合成作用评价 表皮 基底层 真皮 皮肤基底层附近胶原蛋白示意图 4型胶原蛋白 7型胶原蛋白 1型胶原蛋白 1型胶原蛋白：存在于真皮的细胞外基质中，形成三股螺旋结构 4型胶原蛋白：多数存在于真皮与表皮之间的基底层中，起到支撑基底层结构的作用 7型胶原蛋白：以环状结构与基底层相连接，维持真皮基质的结构 对被检物质是否能提高人体
9、皮肤成纤维细胞的1型胶原蛋白合成作用 进行评价。伴随年龄的增加及外界环境的影响，皮肤内的1型胶原蛋白含 量会减少，从而形成皱纹和皮肤松弛。本评价项目，通过向人体皮肤成 纤维细胞添加被检物质后，测定细胞内1型胶原蛋白合成量（ELISA法） ，根据结果评定被检物质是否具有促进胶原蛋白合成的作用。 蛙 隆 择 薛 家 稀 嫩 寿 闺 披 掐 哑 控 唤 圃 羡 巡 抚 赦 见 除 妙 檄 场 铬 侠 眩 佩 惜 瓤 窃 瞄 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 胶原酶活性阻碍作用 胶原酶是一种能水解胶原蛋白的三维螺旋结构的分解酶。体内胶原酶 会随年龄的增加以及外界环境的作用
10、下，促进其活性的增加，从而加速其 对胶原蛋白的分解，破坏皮肤结构，出现皱纹、皮肤松弛等皮肤衰老迹象 。 让胶原酶与添加了被检物质的胶原蛋白反应，测定胶原蛋白的分解程 度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍胶原酶活性增加的作用，评 估被检物质的衰老作用。 弹性蛋白酶阻碍作用 弹性蛋白酶作用是分解维持肌肤张力的弹性蛋白。随着年龄增 加、过多活性氧的堆积促进弹性蛋白酶分解弹性蛋白，是形成皮肤 衰老的因素之一。因此，阻碍弹性蛋白酶活性，可恢复肌肤张力， 起到抗衰老的作用。 让弹性蛋白酶与添加了被检物质的弹性蛋白反应，测定弹性蛋 白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍弹性蛋白 酶活性增加的
11、作用，评估被检物质的衰老作用。 捅 肪 蕾 滓 秘 抑 模 雀 暮 赤 嗡 戊 释 徽 猖 坑 娩 迟 珠 勤 苑 夜 尔 歌 聊 芯 马 凹 滥 束 记 梦 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 促进玻尿酸合成作用评价 玻尿酸是一种高分子的多醣体，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄 糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，平均分子量介于10万到 1000万Dalton之间，存在于人体皮肤组织中，填充在细胞与胶原纤维 的空间中。具有保持皮肤弹性功能，锁住大量水分子，对组织具有保 湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性。 但随着老化及年龄的增长，玻尿酸流失速度比生长速度快时，肌 肤
12、也逐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，出现皱纹等老化现象。 本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞或人体表皮角质形成细 胞添加被检物质后，测定细胞内玻尿酸合成量（ELISA法），根据结 果评定被检物质是否具有促进玻尿酸合成的作用。 缚 踌 眨 诲 宋 鸵 茄 摄 貉 瘁 锭 赤 天 分 崔 恍 湍 差 忧 讶 畅 甥 餐 挑 旺 孰 混 籍 蛊 抄 绣 娶 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 3、美白作用评价 美白是指抑制由紫外线照射所生成的黑色素，防止色斑的产生， 恢复肌肤的原本色泽。黑色素是存在于人体皮肤基底层，在紫外线照 射下会产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后
13、黑色素又经细胞代 谢，逐步到达肌肤表皮层，形成色斑和色素沉淀等问题。 美白化妆品可排除皮肤细胞中积累的过 多黑色素，具有淡化色斑、色素沉淀的作用 。 美白作用评价是通过多种美白评估法， 分析美白成分、美白产品对由紫外线引起的 色斑的改善效果以及色素沉淀的抑制效果， 客观、有效的评价其美白功效 色素沉淀及色斑生成示意图 贩 洗 马 旭 蒜 权 连 榷 尘 寻 淄 根 馋 峭 尖 锹 泌 物 诵 丽 淀 促 范 太 像 毖 铀 扁 憋 嫡 噶 毗 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 黑色素生成抑制作用 黑色素细胞受到紫外线照射后，启动人体保护机制生成黑色素， 黑色素吸收
14、紫外线的作用避免皮肤细胞受到损伤。但持续的照射促进 了黑色素细胞活性，导致生成了过量的黑色素，从而在皮肤上形成了 色素沉淀与色斑。因此，化妆品成分、产品的黑色素生成抑制作用是 评价其美白功效的重要参数之一。 本评价项目，将被检验物质添加到黑色素瘤细胞培养，测定黑色 素瘤细胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，评估其 美白作用的功效。 评价平台：B16BL6 小鼠黑色素瘤细胞 样品处理后黑色素生成效果 样品浓度 小 大 黑色素抑制效果 小 大 彻 琼 鹃 咆 峪 北 口 勿 肺 颂 施 陇 迁 旭 掘 穗 猾 镍 甚 微 际 鳃 礼 蝗 郴 炬 失 健 险 购 粥 福 体 外 评 价
15、体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 酪氨酸酶活性阻碍作用 酪氨酸酶（Tyrosinase）是黑色素合成的关键酶。对酪氨酸酶活性进 行阻碍可抑制黑色素的生成。 本评价项目将被检物质与标准物质进行酪氨酸酶活性阻碍效果对比， 以及被检物质浓度与阻碍效果关系的分析。 黑色素形成途径以及酪氨酸酶活性作用 狗 踊 搭 讣 踢 档 乱 蠕 吓 烯 铭 档 舷 掸 饰 草 纲 瘫 症 几 钵 啊 宅 殴 昭 米 原 募 脆 觅 水 煞 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 黑色素分解作用 维生素C的黑色素分解效果实验操作示意图 持续受到刺激的黑色素细胞会生成过多的黑色素，
16、形成色斑与 色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妆品可淡化由黑色素引起 的色斑，缓解色素的沉淀。 本评价项目，通过酪氨酸酶的酶作用将酪氨酸 合成为黑色素 ，然后添加被检物质测定其黑色素分解效果，根据结果对其黑色素 分解能力进行评估。 认 醉 惺 丸 惨 吧 宅 贿 蒸 诞 姿 桐 橙 步 你 气 陵 可 滇 料 捂 哪 穿 峻 匡 孰 跋 弓 析 掀 渴 姑 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 4、DNA损伤修复作用评价 环丁烷嘧啶二聚体增加的抑制作用 环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane Pyrimidine Dimer, CPD）是DNA 受UVB 照射后造
17、成的主要伤害 形式 。使用正常的人体细胞测试被检物质能否抑制 由UVB照射诱发的CPD的增加，从而评价其DNA损伤修 复的作用。 皮肤在UVB照射作用下，DNA分子吸收光能量后，造成DNA损 伤。如不及时修复受损DNA，会引起DNA结构的变化，阻碍DNA的 复制和转录。诱发机体的光老化，严重者导致皮肤癌。 CPD结构式 吱 篆 婉 殴 淋 竟 置 铸 拨 葬 查 曾 殴 说 豫 纯 卯 坤 车 河 黄 灸 谍 杜 侦 娇 旁 汲 锭 韧 毒 酒 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 COMET Assay（彗星测定） COMET Assay（彗星测定）也称为单细胞凝胶
18、电泳测定技术， 它是一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法。 DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，由于这些 DNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形 成彗星状的图像，而未损伤的DNA部分保持球形。 DNA受损越严重，产生的断片越多并 且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越 大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察 到尾长增加、尾部荧光强度增强。可用于 DNA损伤预防及修复作用的评价。 UVB照射后 样品 COMET Assay 结果 磨 晤 著 语 吓 窟 烙 性 臣 猾 岁 销 训 遥 入 君 柄 舀 估 窿 匝 女 遁 羡 亥 矿 备 体 红
19、租 柴 浮 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 三维仿真皮肤组织模型 三维仿真皮肤是由正常人体成纤维细胞与人体角朊细胞构成，可 作为代替动物实验的仿真皮肤组织。 主要应用于医药制品、食品、化妆品等成分的刺激性、急性毒性 、美白效果的评定，比传统的皮肤实验，其稳定性好，再现性高。 3D-Skin 实物图 3D-Skin 剖面示意图 角质层 表皮 真皮 培养基 鼻 忍 隋 艰 一 凡 恨 喜 粮 沃 牢 蛛 弓 焉 结 榨 家 寸 本 赵 哇 版 惭 觅 绊 活 摧 窃 骂 冈 吁 啦 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 体外评价相关仪器 紫外分光光度计酶标仪奥林巴斯倒置荧光显微镜 井 渝 钮 冬 嫉 鸯 碌 湾 识 酪 揩 辙 罩 淮 雌 娠 奉 况 社 阐 时 聂 须 卜 澄 赃 迈 戏 范 消 旺 宾 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍 体外评价相关仪器 Bio-Rad 凝胶电泳 Eppendorf 5804R 冷冻离心机 啤 容 扬 出 短 业 铅 耶 摩 蹿 谬 炯 碑 糖 诈 搞 第 检 飞 栏 傀 芒 敝 森 巨 箩 亚 镭 山 揉 掂 支 体 外 评 价 体 系 介 绍 体 外 评 价 体 系 介 绍