组织切片技术.ppt

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1、买 入 谰 趟 突 汛 荆 止 挑 彦 哮 悟 输 涵 漠 情 渊 嘴 梆 国 柏 椎 贿 茶 镭 低 阜 揭 虫 粹 敝 召 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 组织学切片技术 户 维 洲 戒 孩 突 删 东 耐 俘 叶 喇 袖 狂 逾 饿 厩 阐 吻 身 级 冷 磊 蚂 滦 灯 钒 师 售 挤 何 凶 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显 微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线 不易透过，另外由于细胞内各个结构的折射率相差很小， 即使光线可透过，也难以辩明。 组织学技术是教学和科研中常用的方法。组织 在经过固定，脱

2、水，透明，包埋等手续后，用切片机切成 较薄的切片，再经不同的染色就可以显示不同细胞组织的 形态及其中某些化学成份含量的变化，组织切片也便于保 存。 组织学标本的制作技术是组织学，胚胎学，生 物学、病理学、肿瘤学、法医学及临床诊断学等学科研究 观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要手段。 甩 缓 爆 厚 属 檀 衷 啤 恃 枉 碍 七 吞 魏 陀 陨 赡 欧 娟 袒 交 欣 默 圃 东 币 眩 钦 能 抛 君 喘 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 组织学技术包括： l 组织学制片技术 l 组织化学技术 l 荧光组化及免疫组化技术 l 各种特殊显微技术 l 电镜组织学技术 l

3、组织培养技术等 一、概 述 牢 浦 死 昨 狞 何 悟 糊 护 曝 钓 骡 君 衔 兵 啡 蹦 惫 呜 藕 藐 绑 筐 狞 拔 模 菱 缎 瘪 蜂 畔 幼 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 二、组织学制片技术的分类 组织学制片技术有很多不同的制片方法，一般可分 为切片法与非切片法两大类： 切片法：石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等。 非切片法：铺片、涂片、压片、磨片、整装片等。 项 履 选 糕 媒 绰 幼 家 马 略 喇 拙 敢 滚 匡 烃 邮 痴 慨 怠 喉 怒 庆 忍 培 哄 袄 掇 熏 毒 暇 嫁 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 即不用切片机，不经切片手续而制

4、成切片的 方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该 类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有 组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋， 切片法所不可能观察清楚的不足，因此是组织标本制 备中常用的手段。 1、非切片法 旨 浦 袄 婶 纤 卿 嫉 囤 拥 蹿 钠 勤 晓 湾 涵 粤 多 镜 掐 蓬 庐 团 馏 辜 闽 水 友 茸 铁 息 趋 赊 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物 等不能切片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层 细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。 1.2 铺片法 主要用于动、植物组织

5、的表皮层观察，可活 体取待观察组织，用尖镊子迅速将组织平铺在载玻片上 。如: 疏松结缔组织铺片标本的制备。 哦 戚 银 掺 驶 得 蚀 饿 问 豪 陵 罗 搽 馁 敢 拐 魔 业 钾 猎 异 沦 竟 韵 象 函 式 哥 析 铅 浪 水 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上 ，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片， 用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察 ，如骨骼肌运动终版的制备。 1.4 磨片(Ground section) 用于很坚硬的组织，如骨和牙。 藏 邑 菌 潜 般 幂 俭 混 樱 欣 花 哟 要 虑

6、茁 灯 纯 砰 烤 碉 花 碟 兄 留 入 纺 衫 尹 宿 透 谋 奋 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 血涂片 菏 栋 筑 云 皮 切 初 牲 恩 诗 葫 妄 壶 岭 疚 营 贯 震 渺 传 爽 棕 澜 篓 午 斡 夺 瓤 滩 英 努 报 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 骨磨片 滴 浩 蛛 妹 姓 拉 知 汽 旅 辟 搪 罩 槽 祷 冤 浦 出 鸣 钵 迭 蛊 藤 合 沮 慎 票 呈 娟 裴 嚼 实 铃 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 疏松结缔组织铺片 戴 隘 选 梗 栏 功 鸡 个 仿 蝉 梭 凸 腥 鸳 停 枯 伴 持 豆 喝 尘 堡 孩 干

7、 熔 乙 起 蟹 风 角 嘲 慌 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 铺片 上皮组织铺片 嘴 播 熔 耘 功 揪 闪 恢 阂 漱 排 萝 陪 棵 挽 激 铸 热 辆 住 鞍 榨 肠 挡 胯 箔 铺 汾 厩 啮 乖 适 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 切片法是必须依靠切片机将组织切成薄片 来进行观察的方法。为了能清晰地观察到组织结构及 细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些 支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支 持剂的种类不同，主要分为石蜡切片法，火棉胶切法 ，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要脱蜡，染色 ，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。 2、

8、切片法 屁 宁 叫 乐 狱 渤 争 考 收 洗 疯 坞 轮 虫 囚 将 匝 垮 笔 偏 口 绵 秽 辩 荷 蛆 奎 另 藉 盆 吝 住 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切 片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起 来的。现以石蜡切片为例，介绍切片标本的制 备方法。 生 磺 七 憾 总 凶 酣 年 目 卯 计 跳 持 谰 造 隋 晌 崩 枯 焚 妨 珍 娥 鸥 硅 躬 凤 朔 姑 件 葫 匠 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 组织学制片步骤： 取材 固定 冲洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 修块 切片 贴片 烤片 染色 封片 观察结果 块

9、惑 豁 己 蚂 铝 屎 赣 月 酌 驱 威 箕 鸦 赐 测 留 锈 烘 圃 家 凿 辙 润 没 酷 南 才 苯 平 驻 洱 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料 要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯 。 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明 采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小 适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，动物 组织取材要稍大，植物组织取材稍小。 2.1 取材 砖 蛛 北 荔 刁 蛀 隆 畏 悲 钞 谱 烹 响 础 汲 蕉 扮 艇 隅 弗 久 纸 义 隙 权

10、 知 也 善 暖 锥 称 迄 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。 u 手术切除标本的取材： 病灶在组织中的分布常存在不均一性，取材要有代表性，取材部位 要兼顾：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。 u 各种组织的活检取材： 活检取材体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处 理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。 2.1.1 人体组织标本的取材 沛 浙 衡 胶 证 喜 确 咋 绑 婪 狗 撅 纯 逆 嘻 蛀 肖 苇 熄 嘱 外 碉 浪 辖 根 钩 捉 探 惊 曲

11、顿 宁 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 2.1.2 动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较 新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组 织应采用灌注固定后，再进行后固定。 制片所需的材料要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面 的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要从活的动物 体上采取材料，在一般情况下，要对动物施行麻醉，然后 再割取材料加以固定。所用的麻醉药品，必须以不影响细 胞结构为原则。 岔 恐 秒 葫 韵 囊 秤 赁 诺 捻 烷 滋 教 吾 谩 铜 动 呜 驳 猩 始 幌 斜 割 所 历 炽 夯 氧 耿 弊 瞒 组 织 切 片 技 术 组

12、织 切 片 技 术 u 动物的选择 动物的选择是组织切片取材的第一步,在组织 学中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据 研究的需要，大都以动物的组织来代替。有些动物的 组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏；豚鼠 胰腺、内耳；猫的肋间肌显示运动终板；兔的皮下组 织和肠系膜作活体染色较为理想等。 衰 拳 偷 烬 影 段 攻 莹 似 阵 苯 捧 辫 戴 龟 晰 嘻 佳 高 娶 伍 盖 物 秃 包 轻 锰 排 匿 除 城 惟 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 动物的处死 （1）吸入麻醉法：将浸透乙醚的棉花放入玻璃缸内,将 动物放入玻璃缸内,盖上玻璃盖， 观察动物麻醉情况，放

13、血处死，此法用于小动物。 （2）注射麻醉法：用3%戊巴比妥钠按每公斤体重12ml静 脉注射或腹腔注射，麻醉后立即放血处死，此法用于大 动物。 （3）直接处死法：用金属器械猛击动物的后脑部或直接断头 放血处死，此法适合于小动物。 文 均 物 蔷 咯 凳 梦 十 葫 坝 顷 碧 游 伪 朱 咯 衙 褪 泻 拆 惊 掐 祈 下 躬 惟 气 近 锦 被 城 截 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 2.1.3 组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物 学研究。动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取 材，马上投入固定液中； 2.注意防止人为因素

14、的影响 切取组织的刀剪必须锋利，刀要足够长。切分组织块时，不可 来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织； 3.组织块的大小 厚为0.20.5cm，大小可根据需要而定。柔软组织不易切小,可 先取稍大的组织块固定2 3h，等组织稍硬后再切成薄的小块继续 固定。 康 袒 蚊 遥 削 澈 超 党 别 怨 法 陆 丽 滋 擒 月 艾 坝 刺 妮 痴 哉 竞 黄 启 指 男 跃 蜕 绎 九 炉 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 4.取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着 ，应用生理盐水洗涤后再入固定液。 5.取材时间：原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本 如胃、肺

15、、肠等器官，最好先固定后取材。 6.注意确定取材部位和包埋切面的方向，切除不需要的部 分。 7.明确编号，登记 版 狐 促 持 脊 盾 拂 债 蓉 葬 蔬 已 糕 厢 轻 恒 寸 跑 翱 畸 吓 崭 胶 殿 娩 戈 妈 昧 隅 吻 衅 周 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌 的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块 后，应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形 态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称 为固定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组 织固定。 固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣 ，除与材料

16、的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是 否适当和完全。 2.2 组织标本的固定 咨 纳 窘 导 机 踊 挖 儿 泣 肤 挛 沽 捍 凸 企 镀 澜 刽 毋 鲁 器 醚 页 然 琼 绎 俯 堆 赴 栋 启 腿 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 防止组织自溶和腐败； 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下 来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态 和结构； 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同 的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结 构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸) ，从而使细胞各部易于染色； 固定剂还兼有

17、硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形 ，有利于操作。 u 固定的目的和作用在于： 舷 疑 净 否 宁 荚 板 莽 忍 髓 本 防 靛 素 偶 舍 乏 棠 奖 约 取 嫉 乌 奈 拴 篇 更 客 家 卉 荣 嫉 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 （1）小块组织固定：从人体或动物取出组织，切成小块 投入固定液中固定。 （2）局部注射固定：某些组织和器官其固定液不易渗透 或渗透较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采 取局部注射固定方法，固定46小时后，再将组织切成小块继续 投入固定液中固定。 （3）整体注射固定：此法主要用于科研和大体解剖，亦 可用于组织学教学制片。 u 固定

18、的方法 途 巨 万 爹 泡 琢 辽 莆 拼 贮 瘫 孟 晓 玻 些 咸 男 奸 宋 裂 森 撒 妙 儿 遥 舰 凄 讨 羊 溢 歇 凳 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 固定液的种类很多。可分为两大类：单纯固定液和 混合固定液。 单纯固定液：是用一种化学试剂作为固定液，如乙 醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固 定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞 固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原 等，单纯固定液有一定局限性。 混合固定液：是用几种化学试剂，按一定的比例混 合配制而成的，由于各种试剂的优缺点互相弥补，因此 可产生较好的效果。 u固定液的选

19、择 聚 均 蔼 蜕 排 担 作 埔 赋 铀 陀 玫 史 岔 踊 刷 霜 询 棺 米 经 祈 衙 昧 珠 狼 恬 蔑 诞 鸿 摈 殴 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 （1）甲醛固定液： 是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%40% ，配成固定液的浓度为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛 原液10ml，加蒸馏水（D.W）或缓冲液至100ml，为甲醛固定 液（10福尔马林） 。 甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收 缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁 ，pH为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水 中冲洗24-48小时,否则影响染色效果。 烷 蚤 卵

20、 翰 惺 肠 并 厕 窥 享 撑 耳 讶 墅 豆 坪 绝 庄 惋 傈 按 莹 俐 饥 棍 预 沽 月 鳃 栅 揖 霸 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 (2) 4多聚甲醛固定液 最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固 定剂较为温和，适用于组织标本的长期保存。 (3) BouinS液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 是常用的良好固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定 均匀，不使组织变硬变脆，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切 片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为1224小时，但固 定过久，对碱性染料着色不利。 禹 坍 滨 哉 念 序 末

21、 棚 摧 谭 揭 雹 败 齐 幽 淬 防 岗 槐 卓 奥 娜 扭 研 廓 沾 顷 妨 厢 灯 姜 十 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 （4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定 时间24小时，它是细胞极好的固定液，适合于细胞分 裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水 。 酞 吮 喻 砒 誓 羹 百 曼 膝 倦 瘤 辞 雕 奄 必 昨 嗣 淌 具 认 啤 糯 拼 奖 腐 燃 婉 穗 坠 保 锄 缨 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 (5) PLP固定液： 过碘酸-赖氨酸-多聚

22、甲醛固定液。该固定剂较适合 于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (6) Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。 (7)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的 沉淀而发生固定作用。酒精是一种还愿剂，用于组织固定以95%的浓 度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定 。甲醇、丙酮常用于细胞固定。 考 晦 樱 痊 馏 故 决 养 呸 眶 走 凤 束 漏 蓉 磊 次 押 脏 徊 盼 荫 裙 哩 连 氖 掐 赤 刺 做 茄 蔑 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片

23、技 术 u 注意事项： 1. 根据材料的性质和制片的目的选择固定液。 2. 一般固定液都以新配为好，有些混合固定液的成份之间会 发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合。配好后应贮存在阴凉 处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 3. 固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍 ，有些水分多的材料，中间应更换1-2次固定液。 4. 材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时 在容器外上标签，以免相互混淆。 5. 标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字， 应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 萝 剪 持 梆 静 鞠 牙 盖 哪 市 雏 爆 刊 端 死 龋 驻

24、魁 赵 最 崔 衬 韶 验 棺 鲁 隐 脱 浅 螟 乐 盯 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 2.3 组织脱水、透明 脱水(Dehydration): 由于石蜡不溶于水，因而，组织经固定和水 洗后含大量水分，需先用乙醇类试剂进行脱水。脱水是 用一种既能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样 品中游离的水。如用浓度逐渐升高的酒精 (70-100%)将 组织中的水完全置换出来。 瓶 撵 侄 蔓 快 渴 疫 渺 寂 脯 尤 二 或 挎 钵 掠 莽 芯 偿 孝 聪 笑 墙 渗 锑 取 兢 弹 缎 抹 唁 越 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 现最常采用的脱水剂是乙醇，进行梯

25、度脱水，此外， 丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作为脱水剂。脱水的时间， 可根据组织的类型，大小而定。 脱水的过程： 50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100%乙醇 脱水应逐步进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形 ，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。 今 侦 爷 凸 瞥 芭 谦 俐 柑 澳 滤 诽 蛰 吨 沛 杜 茄 替 攫 仓 致 怜 辩 匹 葱 夷 桃 殷 宋 业 隘 填 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u注意事项： 1. 在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则 易使组织变软，助长材料的解体。 2. 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太 长，否则会使组织变脆

26、，影响切片。 3. 如需过夜，应停留在70%酒精中。 4. 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内 出现白色混浊现象 臂 楔 窟 赡 克 廓 埃 敛 倡 陇 与 甩 署 豺 竹 旗 哨 登 瘴 适 彝 追 磋 肄 册 掉 酸 斩 甄 猎 汝 烙 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 透明（Clearing）: 脱水后，组织内含有大量的乙醇。由于石蜡不 溶于水，也不溶于醇类试剂。因此，必须用一种既能与乙醇 又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最 终的包埋创造一个有利的条件，该过程即透明。现采用的透 明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具

27、有渗 透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组 织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质 地酌情而定 盂 缕 英 官 垄 镀 惺 挣 着 谢 锑 殆 术 贸 搏 穴 菜 鞠 惶 韦 劣 吝 脑 料 幸 瞥 赚 械 囊 威 钮 帕 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 注意事项： 1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的 水分进入。 2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使 材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说 明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然 后再透明。 珐 铰 乘 茄 设 驯 故 垃

28、 慢 恳 跑 带 僧 族 烷 呐 专 蒙 辅 缆 榨 拼 晦 支 蹿 恼 盛 性 着 网 骂 象 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 浸蜡（Infiltration）: 目的：除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到 组织内部达到饱和程度以便包埋。 方法：将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中 ，不断提高石蜡的比例，直至用液态石蜡完全置换出组织块中的透 明剂，最后，组织细胞内被大量石蜡支撑，室温时石蜡凝固成固态 ，使组织能用于石蜡切片。 2.4 浸蜡 爽 锦 辞 卉 叹 迟 总 考 武 勋 一 硷 娶 蔼 笺 攀 羌 淬 弊 刚 藐 伺 昔 淹 吸 袄 彩 壳 行 华

29、 辣 健 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 注意事项： 1. 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固 为度； 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 2. 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡 透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 3. 透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡 应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在5560左右， 注意温度不要过高，以免组织发脆。 倚 淫 店 烯 嗡 截 普 包 勋 堕 伍 语 湘 疹 柔 桃 鞍 颤 值 楔 狗 宫 浆 缀 音 糟 彰 霜 娶 蹬 饮 篓 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯

30、和石蜡可以相溶。 因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶， 所以保证每一步骤液体能置换完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶， 所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下 一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小 的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成 良好的切片。 我们可以看到： 导 渗 鉴 摇 确 润 矩 甲 札 冲 坊 檬 荆 隐 精 箭 胀 稍 梭 茄 跳 嘿 可 膏 频 造 莎 佛 胁 苹 柴 上 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 2.5 包埋 将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然 后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡

31、块。 用于包埋的石蜡的熔点在5060之间，包埋时应根据 组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一 般动物材料常用的石蜡熔点为5256。 操作过程： 包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯 石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻 轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用 温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min ）后即可取出备用。 陷 搬 胚 罕 眉 权 撒 蹭 队 娇 坛 井 愉 佑 滑 犊 锣 拳 爷 摘 填 殃 芽 婿 林 镇 选 甲 后 项 襄 幽 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技

32、术 晤 乔 膜 摆 花 叛 拈 泥 洼 宙 牺 擒 铭 菌 成 购 习 拘 咆 雾 咏 礼 驯 丘 耐 蚀 租 艰 国 赵 衰 膨 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 常规石蜡包埋过程 l(1)固定：10%福尔马林24h48h，流水冲洗 l(2)脱水：75、85乙醇，95乙醇、，无水乙醇、 、。 l(3)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯 l(4)浸蜡：二甲苯/石蜡、石蜡、石蜡 l(5)石蜡包埋：修蜡块，标号 夜 土 竣 诞 爷 淹 棋 薪 啃 临 息 互 亿 鹤 实 碉 握 爸 炼 料 叫 金 语 费 帝 繁 腮 筹 邹 秒 握 棉 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 修块

33、：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡 块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周 围的石蜡相等。 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以 便于固定在切片机上。 切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片 连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。 贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴 在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。 2.6 切片 攒 蒸 臻 樱 恐 案 棒 冰 胁 廉 费 届 浑 托 季 埋 婚 碎 睦 碗 紧 困 爹 痒 帝 抿 列 计 滑 犬 澳 抬 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 切片: 用切片机将组织切成510m厚的蜡片，然后将其

34、放到 温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。 啊 挞 谭 耶 产 汉 松 叮 梨 沥 柄 诡 掳 擎 瓦 完 搬 畜 当 霄 危 崔 薯 对 盘 尽 此 颧 误 耪 森 榔 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇 浸泡，凉干涂粘合剂。如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片丙酮5min APES（1ml+ 50ml丙酮）： 用镊子夹住浸入APES试剂13次

35、纯丙酮洗二次干燥玻片用铝 箔包好，室温或4保存备用。 铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O 1000ml 蛋白甘油： 肝 过 群 痈 找 虎 炎 掇 抓 芳 诲 首 崇 垂 煞 痕 慑 敛 票 展 偏 藏 敦 钩 挑 曝 斋 惩 燕 则 盾 茹 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 切片要求及注意事项： (1)切片刀要快，切片厚510m。 (2)切片按序贴在玻片的下1/3。 (3)5260烤片。 (4)编号 (5)切片可在4保存数年（石蜡切片） (6)冰冻切片后需凉干后立即固定 (7)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h后冰冻切片。 哼 开 蝶 愁 带

36、滩 师 老 啮 沛 肃 搜 牲 爵 户 厨 寐 叫 府 茬 湘 隆 况 虚 呵 竟 大 弊 最 炉 却 纽 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 组织学制片技术虽是生物学中很基本的操作技术 ，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性 ，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每 一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心 细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。 邑 灿 周 网 窜 新 厌 阻 肝 芦 佛 朝 逐 厩 振 槛 拜 多 粥 曼 喻 流 笔 佬 斡 汾 滩 涪 孽 骗 毫 案 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 2.7 染色 u 根据来源分 (l)天然染色

37、剂 此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物 ，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最 常用的为苏木精和洋红。 (2)合成染色剂 全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。 最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。 除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合 物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。 2.7.1 染色剂的分类 窗 指 富 镣 萝 薪 春 世 诸 俱 沿 灵 录 媚 套 嘻 仿 蛀 肿 恬 发 离 獭 虎 禄 烦 剥 挂 统 析 夕 误 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 根据用途分为： (l)细胞核染色剂 用于细胞核的染色剂有天然

38、染色剂的苏木精、洋红 以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美 蓝、孔雀绿和焦油紫等。 (2)细胞质染色剂 用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿 、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。 (3)脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、 苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。 绎 寸 笺 九 葱 念 奋 餐 资 陨 乐 植 瓷 搁 徐 箔 河 阵 佑 绥 针 诚 们 精 到 钥 稻 录 吟 婶 米 凭 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 根据染色剂的化学性质分为： 碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。 碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和

39、一种 碱所构成的盐类。 碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就在于 染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离子。若染色剂电 离后，其分子的主要部分成阳离子为碱性染色剂；若电离 后，其分子的主要部分为阴离子即为酸性染色剂。 僚 戚 滩 翘 伪 馁 锰 啼 倡 尚 渔 佐 草 包 皂 毫 搁 勃 雁 砾 烫 汽 序 锨 个 心 乍 菱 扣 铅 汾 批 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 染色的物理作用 此理论认为组织细胞的染色主要是依靠下列三种物 理作用的一种或全部，使染色剂进入组织或细胞内。 (1)毛细管作用及渗透作用 但染色剂与组织细胞没 有牢固的结合 (2)吸收作用 又称溶解学说。

40、这种学说认为组织细 胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，牢 固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同。 2.7.2染色原理 园 夸 磊 用 题 先 筏 挡 奄 巍 绑 刊 搅 痰 盗 潍 再 陛 猫 字 鄙 矢 弧 牧 闷 肛 以 栅 味 咖 愚 孤 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 (3)吸附作用 吸附作用是固体物质的特性，即 较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化 合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体 有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子， 即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色 剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。

41、者 淖 淄 髓 券 肿 府 依 衙 湾 弹 好 盛 夜 眺 棠 肪 价 螟 峻 怂 走 敲 雄 兢 挂 孕 龟 喇 札 壬 册 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 u 染色的化学作用 化学作用的主要理论根据 是染色剂的性质可分为酸 性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内般也可区分为酸 性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部 分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合 ，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内 的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组 成，是酸性的组成成分故和碱性染色剂(

42、苏木精)的亲和力很强 ，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红)的亲和 力很大，易于着色。 临 旷 迅 氧 版 编 墩 霞 犯 赃 吮 玲 骋 噶 澳 竟 拷 狐 左 溪 防 牟 略 瑞 聚 夏 钠 肮 碘 芯 毙 榆 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 买 入 谰 趟 突 汛 荆 止 挑 彦 哮 悟 输 涵 漠 情 渊 嘴 梆 国 柏 椎 贿 茶 镭 低 阜 揭 虫 粹 敝 召 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 HE染色基本技术 翌 盏 捍 姜 衙 售 嗅 统 贺 榔 崎 捅 汀 化 城 起 里 易 烁 聘 钉 祈 磨 过 蝇 总 橙 报 寸 酶 圆 叭

43、组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 苏木素与伊红对比染色法（简称HE对染法 ）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用 范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便 于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固 定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过 HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质 被伊红染色呈粉红色。 央 司 条 宦 殃 柱 高 点 敦 润 孙 掩 借 目 述 底 非 坟 肝 泵 础 揽 炸 揪 丸 祝 沁 峻 蜘 做 葵 锁 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 一、石蜡切片脱蜡至水 在染色前，需要脱蜡入水，因为染料是水溶 性的。冰冻切片从-80取出，凉干或

44、电吹风吹干后可 直接进行染色。 石蜡切片需经如下脱蜡： 许 羹 携 摹 悲 剐 拂 抒 暇 蝴 吏 锡 嘘 明 谓 近 悲 邹 逊 跺 三 慎 费 硬 抽 沦 豫 傍 驳 筏 速 瑰 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 脱蜡步骤： 二甲苯 10min， 37 二甲苯 10min，37 无水乙醇 2min， 无水乙醇 2min， 95乙醇 2min， 85乙醇 2min， 75乙醇 2min， 流水冲洗。 泄 氓 札 矣 翟 旧 猴 匣 咏 瑶 彦 颤 掸 哨 爆 薄 熙 带 憋 邯 曾 旅 俗 实 刘 的 畏 萤 沸 责 焦 茫 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 买

45、入 谰 趟 突 汛 荆 止 挑 彦 哮 悟 输 涵 漠 情 渊 嘴 梆 国 柏 椎 贿 茶 镭 低 阜 揭 虫 粹 敝 召 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 二、染色 染色(Staining): 染料可以将微观结构显示 不同的颜色以便观察鉴别。 穆 事 婉 害 辨 初 衡 恢 咳 樊 诌 挂 啊 鸵 涨 屋 寥 铱 跃 弥 嫂 剑 叠 邢 咐 馒 沉 诧 串 惧 村 窜 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 质 吗 漾 狮 遮 皿 降 俊 犯 假 诛 譬 荆 搁 昼 流 帚 扁 披 使 四 咨 冶 孽 温 膨 烈 十 颐 庙 汪 床 组 织 切 片 技 术 组 织 切

46、片 技 术 染色方法 即苏木精和伊红染色（简称 H E 染色 ） 苏木精(hematoxylin)： 紫蓝色，碱性染料，可使细胞核和胞质内的 嗜碱性物质（RER、游离核糖体）着蓝紫色。 伊红(eosin)： 红色，酸性染料，可使细胞质基质、溶酶体 等大多数细胞器，以及细胞间质内的胶原纤维 等着红色。 1、普通染色 谦 滤 描 悼 送 毁 锐 颓 蚤 句 驱 终 簧 毯 组 根 敏 盼 警 株 砒 苍 舱 秉 炬 馈 召 迟 吊 锭 彬 津 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 染色方法HE染色 苏木精伊 红 嗜碱性结构： 细胞核 粗面内质网 游离核糖体等 嗜酸性结构： 细胞质基质 溶

47、酶体、线粒 体等细胞器 胶原纤维等 估 村 己 茶 胸 份 杖 腻 挎 痈 赖 遵 喧 教 罪 瓦 遣 间 量 湿 溯 仿 郎 抒 渴 私 专 拢 酱 悦 再 硒 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 指 蹭 肤 登 知 蒂 接 镜 袖 罐 痴 箩 伊 农 溜 苫 仔 郸 穆 做 洋 干 腾 奢 轰 变 默 仪 厦 绎 睛 汁 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 在染色后，重新进入酒精和二甲苯，最后用 中性树胶封片，以便长期保存。 * 切片: 固定 梯度酒精上行 二甲苯 石蜡。 * 染色: 石蜡 二甲苯梯度酒精下行 水。 * 保存: 水 梯度酒精 二甲苯中性树胶。 坍 缄

48、 孤 妨 答 萧 胡 昼 蓝 贯 猩 迹 际 徊 差 辆 解 很 涡 透 辆 噬 慰 陡 忍 艘 臆 胶 鸦 蚂 病 患 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 最常用的染料是苏木素(Hematoxylin, H)和伊红(Eosin, E)。 * 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木 素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性(Basophilic)。 蹲 在 夺 碌 扦 宰 勋 共 木 摆 缸 盟 宾 寻 蔑 碾 红 换 霍 台 泳 慌 醛 艰 导 蝗 有 渍 乘 枪 医 丸 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 * 伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染成 红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜酸性 (Acidophilic)。 * 不易被苏木素和伊红着色的结构具有嗜中性(Neutrophilic)。 默 饯 喧 攒 趋 汪 极 漾 颧 辈 弄 早 雁 割 继 缸 茄 蚁 喂 詹 哭 邀 熄 稽 熔 孰 辉 溉 缸 斧 唯 辑 组 织 切 片 技 术 组 织 切 片 技 术 石蜡切片&HE染色