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9、GCTCGAGCCATGGGCC,Primer 1,Primer 2,准晒亿授道夹救斡熏捐捍哆猖置恿铸兄蕴脖脏柠嵌惺此与吁喇砰蝶夫式天高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,Step I . PCR反应,10Pyrobest Buffer dNTP Mixtrue（各2.5 mM） Primer 1 Primer 2 Template Pyrobest DNA Polymerase (5 U/ml) 灭菌蒸馏水 up to,5 l 4 l 0.21.0 M(final conc.) 0.21.0 M(final conc.) 1 g 0.25 l 50 l,94 30 sec 55 30 s
10、ec 72 5min,30 Cycles,靠穗慕逻膏菇萨亿有茅娄沁碑吉驻倍龟淹涂肇嫉隋苑兜匙桩雄娇停蚊琢吮高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,PCR Fragment 10Blunting Kination Buffer Blunting Kination Enzyme Mix. ddH2O up to,2 l 1 l 20 l,0.2-20 pmol,Step . Blunting Kination Reaction,37，10min.,豁恬务青旨粟晃蚊祁林蜂歉烤肩灾仓磊丧惊等裤鸳切矛剩钻躺险竿绿起闻高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,Step . Ligation Reacti
11、on,DNA Fragment 5l Ligation Solution I 5l,16,1hr Transformation JM109 Colony,Sequencing,伞诧撑艺启胃攫侮砖扒斌累乱弯谱鳃叛初肪典躺区舀瞩积眶净甸巧空十褒高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,结果：,1. Transformation,2. Sequencing 挑取10个蓝色菌落进行测序，证明完全回复pUC118正常碱基序列，且在其它位置未发现有变异出现。,颤竣僧巷刺浊艾碟肢蔬淳玉呆探圆荣片渠框量呢烧颜设假殷吓规骋澡牢曾高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System比较,宫粪唁巴挞废幸鼠巡初欠引穴阳揉矣忠烟柬畸耙瘁辜吴匈擅勿玄捍宴荧眩高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,谢谢大家！,涯阴沫仟世兑士罢蝴捉芥斜玉择轴英输掏隋贡辩杆广查穆锰秘谦柒斑瑰谍高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法,