第8章维生素B6测定.ppt

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1、第8章 维生素的测定,8.1 维生素B6的测定 8.2 VB2的测定 8.3 高效液相色谱法测定维生素,遵扶谱邮寇帜殷居量逃曝屑旋拭膊泣宁缕晚臻怂杯衰啪豁腋胆计歹池招境第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素：维持人体生理功能所必需的、含量极少但具有重要生理功能的、含量极微的天然有机物质。 维生素种类： 水溶性:VB1、VB2、VB6、VB12、VC 脂溶性：VA、VD、VE、VK,昌因历熊窥耀胚顷吕补娇焉师伙吐寻仇炽愤永椎页勾疑冀地连益渡仿数预第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B1。保持循环、消化、神经和肌内正常功能；调整胃肠道的功能；构成脱羧酶的辅酶，参加糖的代谢；能

2、预防脚气病。 维生素B2。又叫核黄素。核典素是体内许多重要辅酶类的组成成分，这些酶能在体内物质代谢过程中传递氢，它还是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的物质。能促进生长发育，保护眼睛、皮肤的健康。 维生素B5(泛酸)。抗应激、抗寒冷、抗感染、防止某些抗生素的毒性，消除术后腹胀。 维生素B6。在蛋白质代谢中起重要作用。治疗神经衰弱、眩晕、动脉粥样硬化等。 维生素B12（钴胺素）。抗脂肪肝，促进维生素A在肝中的贮存；促进细胞发育成熟和机体代谢；治疗恶性贫血。 维生素B13（乳酸清）。,瘁扁囚请铃韩萝柑否派父望卓畦掠刷碱秤矾亚塘躲诣灰稿鹅峦叙支谈斤减第8章维生素B6测定第8章维生素B6测

3、定,维生素B15（潘氨酸）。主要用于抗脂肪肝，提高组织的氧气代谢率。有时用来治疗冠心病和慢性酒精中毒。 维生素B17。剧毒。有人认为有控制及预防癌症的作用。 对氨基苯甲酸。在维生素B族中属于最新发现的维生素之一。在人体内可合成。 肌醇。维生素B族中的一种，和胆碱一样是亲脂肪性的维生素。 维生素C。连接骨骼、牙齿、结缔组织结构；对毛细血管壁的各个细胞间有粘合功能；增加抗体，增强抵抗力；促进红细胞成熟。,卜宪胚护矮腆尝车玻沛倔起案谦霖丑肮授宗滓卢侠矽矽中方回疟锁然潮热第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素P。 维生素PP(烟酸)。在细胞生理氧化过程中起传递氢作用，具有防治癞皮病的功效。

4、维生素M(叶酸)。抗贫血；维护细胞的正常生长和免疫系统的功能。 维生素T。帮助血液的凝固和血小板的形成。 维生素U。治疗溃疡上有重要的作用。,憋茵疚谷饼桓车敞幂跌狸巧臀榨便禄穆鉴出俏鸿壕蓟程延鲜编案谷大瞥坷第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,8.1 维生素B6测定,1、适用范围 本标准适用于所添加维生素B6的测定。 测定范围为0.083.5g/mL。 2、 原理用水提取，在pH7条件下，用荧光法测定维生素B6。,誉磋总摇敲俭粕社春浆梗赶豁处根按宿拳仿遭傅头很个蚁姬承蛤馅虏旗修第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,3、 试剂和溶液 3.1 pH7缓冲液称取29.3023

5、g磷酸氢二钠（GB 1263）和3.8115g柠檬酸，于100mL容量瓶中，用煮沸后冷却的水，溶解并定容至刻度。混匀备用。 3.2 维生素B6标准贮备溶液称取40mg（中国药典参照标准）维生素B6，或复合维生素（中国药典参照标准）B640mg， B1100mg，B250mg（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，加水溶解定容至刻度，此液1mL含400g的维生素B6。 3.3 维生素B6标准工作溶液 吸取（3.2）贮备液1mL于100mL容量瓶中加水稀释至刻度，混匀，此液1mL含4g的维生素B6。,气呜厂辛仿允琶六幸麦慌郁顺伦灭待国膀鲁克潍讶抠纬拟者钟掳彬泽欠衣第8章维生素B6测定第8章维

6、生素B6测定,维生素B6测定,4 仪器设备 4.1 荧光分光光度计； 4.2 分析天平：感量0.0001g。 4.3 实验室用器皿 容量瓶 1000mL，100mL，50mL，25mL。 刻度移液管 10mL，5mL，1mL。,将拂醒奇据浴狐罐瘸镐生床凌咀渝登扩盈粱沉照趟浅庆快泼签捌啊娄饵衍第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,5 、分析步骤 5.1 试样的选取和制备 选取有代表性的试样，粉碎通过0.28mm孔筛，用四分法缩减至100g，密封保存，以防试样维生素B6变化或变质。 5.2 测定步骤 5.2.1 维生素B6的提取 称取试样0.52g，（精确至0.0001g）于1

7、00mL容量瓶中，加水溶解后，定容至刻度，振荡12min，静置待沉清，或离心（400r/min）10min。,难遣厂咐打熄惯雀对珐惰锌诚妒肖符台乍惹炭嵌哄鉴读赖于乡络毯簇澡脓第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,5.2.2 试样的测定 移取试样的上清液1mL（40gVB6）于25mL容量瓶中，加入（3.1）pH7缓冲液至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长326nm、发射波长395nm测定其荧光强度。 同时做空白试验。,隧景桃疏羊螟猫爱巾弊抵符炔纠棘里瞬毕掐审骗霄阂黑果躬铁宅惹乓毒骡第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,5.2

8、.3 工作曲线的绘制 取0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50mL维生素B6标准工作液（3.3）分别于25mL容量瓶中，加入pH7缓冲液（3.1）至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长326nm、发射波长395nm测定其荧光强度，以荧光强度为纵坐标，维生素B6量为横坐标，绘制工作曲线。,栈牵晃虚柱惑始贪柒滩滇森讲七郎推绊床活配乘佩漆蛀遵捡昌崭适泰债疽第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,6 分析结果计算和表述 维生素B6的含量（mg/kg）按下式计算： VB6（mg/kg）MD/W（1000/1000）MD/W 式中：M工作曲

9、线上查得维生素B6含量，g/mL； W试样的质量，g； D试样的总体积，mL。,罗咕币锹钒啊魏泰砧沉泳存瑚爷联谈拴沦基清旷栽征搅烫瞧公挟畔铂噬冤第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B6测定,7 、允许差 7.1 每个试样称取两份平行测定，取算术平均值为测定结果并保留两位小数。 7.2 维生素B6含量少于40mg/kg以下，平行测定结果相对差值不大于10，维生素B6含量大于40mg/kg的平行测定结果相对差值不大于5。,灵坚歇稀访铸恐欣且笼目爸航搽犹铲钻嘲沁刨守蛤叼吸虽努左乾顽姥薄村第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,8.2 维生素B2测定,1、适用范围 本标准规定了饲料中维生

10、素B2测定方法。 本标准适用于维生素B2的测定。待测液中维生素 B2检测浓度为0.050.2g/mL。,唬滓螺亡纂槛疮辽农幢赠支狐鲤骸妻孟谦页氓棕诞绒百箭助赠辛缠夹隔漱第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,2、方法原理 维生素B2（即核黄素C17H20N1O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内 其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光 强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。,哼邻瓶锹钎芳许沦疹殴壁斡硕摈誉雪之淫盖炳磊抉脱鸥骡破酒洲增岳晦沦第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,3

11、、试剂和溶液 3.1 盐酸溶液，0.1mol/L：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。 3.2 盐酸溶液，1mol/L。 3.3 氢氧化钠（GB 629）溶液，1mol/L。 3.4 冰乙酸（GB 676）。 3.5 冰乙酸溶液，0.02mol/L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。 3.6 高锰酸钾（GB 643）溶液，40g/L。 3.7 过氧化氢（HG 31082）溶液，100mL/L。现用现配。,釜洁昭烙显胰乎媳屉虏辽驼返奔冕惕剁奢佛贱饥褥庞竣寸晌坊峨鹃缅毛勃第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,3.8 核酸素标准溶液 3.8.1 核黄素

12、贮备液：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol/L乙酸溶液（4.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4）保存。 该溶液每毫升含0.1mg核黄素。 3.8.2 核黄素贮备液：取核黄素贮备液（4.8.1）10mL用0.02mol/L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4）保存。 该溶液每毫升中含10g核黄素。 3.8.3 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液（4.8. 2） 10mL，用水稀释至 100mL。现用现配。 该溶液每毫升中含1g核黄素。,血貉寒醉眯由续稗

13、孝舵捕企丘磺矩虏中质后锡侮搬垮秩宛酝站操排杖炎悯第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,3.9 荧光素标准溶液 3.9.1 荧光素贮备液：称取荧光素（Q/HG 22786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4）保存。 该溶液每毫升中含50g荧光素。 3.9.2 荧光素标准工作液：取荧光素贮备液（4.9.1）1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低温保存。 该溶液每毫升中含0.05g荧光素。 3.10 溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB 3386）0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05mol/L）2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变色

14、范围ph4.65.2。 3.11 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（Q/HG 2001），防止吸潮。,扁驴肿岿翰坠贵民域恃塔馆撩泽掷蛋华舍狠卤蔓歌疥哭渊琵札弗骂邑市昨第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,4、 仪器、设备 4.1 荧光分光光度计。 4.2 分析天平：感量0.0001g。 4.3 电热恒温水浴。 4.4 具塞玻璃刻度试管，15mL。 5、 试样的制备 采集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。,岔撰闺欠牢变衔歼追煮携辜淤股误您缀萄瞎莲媒巧障蝴拇乔奴歹漆观漂乱第8章维生素B6测定第8

15、章维生素B6测定,维生素B2测定,6、 分析步骤 6.1 称样：称取12g，精确至0.001g。精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。,砖拖想益疡啃祈九交哉华莉讽斋膘评靴嘛伍蜂津氢腾艰斤换滚候蓑键诣蹋第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,6.2 样液的制备：向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液（3.1），于沸水浴中加热30min，开始加热510min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于12112315 磅高压釜中加热30min。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（3.3）调节pH至6.06.5，然后立即加稀盐酸溶液（3.2）使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色

16、）。用水稀释至刻度。,沪艘狙芍吵盖陪吨貌喜幕橱献吊碌易墩擂侦理镐筏孙烬嚏眠紫蘑昼涕惧大第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初510mL溶液，收集滤液于100mL 锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1g/mL（以下操作避免紫外光照射）。,匆检缕帚剑铆跌栗音雾腻竭掳穴乘敝辗攫叭卯耶宜荐绦菊邮无琅忿窘企润第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,6.3 杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管（4.4）中

17、各吸入样液（6.2）10mL，同时做平行，向试管a、b、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素工作液（3.8.3）。然后各加入冰乙酸（3.4）1mL，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液（3.6）0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（3.7）0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。,驾狐枷舍消诅偿果拱蜂痛禽才瞬耻廖冉胎敲实措英陪增蔫糯排惮壁憎兴券第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,6.4 测定：用荧光素溶液（3.9.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长52

18、5nm，测定试管a、b的荥光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定卒荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。,判冯匠掘命蛆阶戳玛示捶斩顿作骆肋峰盲努蔷窟讨洗贤闹拢辖奔弃涉非犁第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,7、 计算方法和公式 核黄素（维生素B2）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式计算： 核黄素（VB2mg/kg）（AC）/（BA）（M/m）（V/V1）R 式中： A试管a（样液加水）的荧光强度； B试管b（样液加标样）的荧光强度； z 试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度

19、； m加入核黄素标样的量，g； V样液的初始体积，mL； V1测定时分取样液的体积，mL； m试样质量，g。 R稀释倍数。 A-C/B-A值应在0.661.5，否则需调整样液的浓度。 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。,郭纷街泌怠幢仆抹粱搽运便民胸恍已和飞啦样缚批兰侵撅辆鼎陵韵诚熙架第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素B2测定,8、重复性 同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值： 在核黄素含量小于或等于5.0mg/kg时，不得超过平均值的15。 在核黄素含量大于5.0mg/kg时，不得超过平均值的10。 在核黄素含量大于50mg/kg时不得超

20、过平均值的5。,蒂元户使连秦炸徊焊顾灿匠扒碰陈方磅享肯换恫鹰埋翌个感黍期轰豺盆定第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素C的定量测定,一、原理： 维生素C又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2,6二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸，2,6二氯酚靛酚的钠盐水溶液呈兰色，在酸性溶液中呈玫瑰红色，当其被还原时就变为无色，因此，可用2,6二氯酚靛酚滴定样品中还原型抗坏血酸，当抗坏血酸完全被氧化后，稍多加一点染料，使滴定成淡红色，即为终点，如无其它杂质干扰样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。,铬茵酚渔谍赤吊戚关恃刁饯因棚此销尝培蝎咸罢抬怨磋应依灭揽骑准抓舍第

21、8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素C的定量测定,二、试剂 1、偏磷酸醋酸溶液：取15克偏磷酸（用时研细）溶于40毫升醋酸及20毫升之水混合液中，然后用水稀释至500毫升，过滤后贮入玻塞品中。 2、标准2,6二氯酚靛酚液：取0.25克2,6二氯酚靛酚溶于700毫升蒸馏水中（用力搅动），加入300毫升冷酸缓冲液（预先配制KH2PO49.078克/升，Na2HPO4.2H2O11.867克/升水溶液，用时以KH2PO4/ Na2HPO4.2H2O=4/6的比率将其混合。pH为6.97.0，日过滤，滤液贮于有色瓶中，临用时，以标准抗坏血酸溶液标定）。,翻乾爵蝎谐弥坊蒂伍枝翘鹿却逮滴蔓闸娱它

22、傀圭偶撅岛四哦粗冲士陌物捉第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素C的定量测定,3、2,6二氯酚青定酚液标定： 标准维生素C溶液（校准时再作），以少量偏磷酸溶液溶解0.1克维生素C于100毫升容量瓶中，再以该液稀释至刻度。 在三个100毫升锥形瓶中，各置5毫升偏磷酸醋酸液，再各加2毫升标准维生素C溶液，摇匀。用上面所制2,6二氯酚靛酚滴定，呈玫瑰红色保持30秒钟不褪色为止。记下所用2,6二氯酚靛酚液平均值，再以同样方法作一空白实验，取7毫升偏磷酸醋酸液加水若干毫升（相当于以上所用之2,6二氯酚靛酚之滴定量），仍用2,6二氯酚靛酚滴定之。将第一次滴定的量减去空白实验的量，即为标准维生素作

23、用之量，求出1毫升之2,6二氯酚靛酚若干毫克之维生素C。,鸵砂缆噪葵叙詹蚤拆昏辗衣援绰露骨蔚祁庚依骆旬胃贤梨傣哦疚屎构拐蒋第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素C的定量测定,三、操作： 提取：用自来水冲洗检样，再以蒸馏水清洗，用纱布或吸水纸吸干表面水份，然后称取20克，剪碎，在研钵中形成浆状，倾入2030毫升3%偏磷酸醋酸液，搅动，抽气过滤液经漏斗流入100毫升容量瓶中，残渣再以20毫升偏磷酸醋酸液提取三次，滤液及洗涤液皆流入该容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，加塞摇匀。 滴定：吸取10毫升提取液注入一小三角瓶中，加5毫升偏磷酸醋酸液，混合均匀，以2,6二氯酚靛酚滴定，并不断摇动，至溶液

24、显玫瑰红色保持30秒钟不褪色为止。 吸取15毫升偏磷酸醋酸液，加水若干毫升（相当于以上滴定所用2,6二氯酚靛酚之量）作一空白试验，用同样方法，以2,6二氯酚靛酚滴定之。,推充权僻柞淮垮沁杰珍淳矣学而挖出棱缆订依钉肇瞻厨俗在融鼻旁以暂矫第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,维生素C的定量测定,四、结果计算： VC% (mg/100g) = （VA VB）已知维生素C毫克数100 100/所用提取液毫升数样品重 式中： VA样品实验所用2,6二氯酚靛酚 VB空白试验所用2,6二氯酚靛酚 注：样品中某些杂质亦能还原2,6二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在30秒钟为准。,夷镶挤墓

25、馅农炕揉椎喊涛茧漱眼附酪酥驮科仁草瑶产备粘轻勘誓楚本荔蓖第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,8.3.1液相色谱法测定水溶性维生素,样品处理 1多维片数片碾匀，准确称取0.19于25mL容量瓶内，加人o.olmol几HCl20mL，超声振荡30min，加水至刻度，混匀静置片刻，取上清液经0.45脚微孔滤膜过滤后进样。 2饮料准确吸取一定量经0.45脚微孔滤膜过滤后，进样分析。 3强化奶粉准确称取49，加人0.olmol/LHCI20ml.，超声波浴10min，加5%三氯乙酸rornl.，超声混匀，用水定容至somL，再混匀后离心(4000rlmin)，取上清液经0.3拌m微孔滤膜过滤后进样

26、分析。 4玉米粉准确称取5一69于loomL锥形瓶中，加人0.l几Hcl40，超声混匀后，于120，103x104Pa高压水解30min，冷却后用水定容至50ml，充分混匀后静置片刻，取上清液经03脚微孔膜过滤后进样分析。以上操作均在避光或低温条件下进行。,发快痞蛔软肠式豌肿刷玩狄月履揪背嚷啸贫腆轧匙池完豪斤罚退域映泅辜第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,2.3色谱条件 采用线性梯度洗脱。流动相A、B从进样时的A+B=90+10线性变化为20min时的A+B=50+50,然后，流动相变为纯甲醇，至30min时，再还原为A+B=90+10。流速1m1/min。 检测波长:VC、VB1、VB

27、2、VC、烟酸和烟酚胺266nm，叶酸278nm，VB12 360nm; 柱温，室温。 标准曲线法定量。,硝录冕舵异存手量赦储殖自嚷夺叫箕侮喜瞪蛔汾峙寓暇乐启系截泽谁奶棵第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,默拄喂烦烙崖冠寿乞洪涨吩链桓童蹭肛雨宾虐灸酶奎炯俯妻粉联杖林佐路第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,8.3.2液相色谱法测定脂溶性维生素,样品处理 准确称取120mg玉米样品,放置在15 mL的塑料离心管中,加4mL冰甲醇(-20),将其混匀后放置在-20下静置提取30 min,将提取液在4以5000 r/min离心30 min。 取上层清液用5-kDa-cutoff的滤膜过滤,

28、滤液经30减压蒸干后,用1 mL甲醇(1+1)水溶液溶解,并用0.45m的滤膜过滤。,毛递汪七姜勒扎锻妖鞭惹咆蛾役蔓肥辗喂唁瓶鹏缉阁洱果烃与搔窃鸣冰访第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,色谱条件 色谱柱：硅胶基质ODS毛细管整体柱 (200 mm0.2 mm i.d.); 流动相：甲醇; 流速： 30L/min; 检测器： UV/Vis检测 检测波长： VD2和VE 290 nm VK1为250 nm VA为325 nm -胡萝卜素 452 nm 温度： 25。,否轻驯雪讥疥夹薯涸咀爬离供揖让枕孪惫以嘎辞肺玖果澎掖秒彬陵络加蛮第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,喳舌扶森龄点呈竞润拘钩怒倾驶港回塌豆合辛截撇束织返蒋漆靛老程沽造第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,烙碍邯艾玻份陕逻脱场画啊焉谚览待髓维燥莹复吃耐处鼻弯滚幕泞硷汗体第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,本章结束，谢谢大家,猿烛橇熙散熄蓖寐介威扰烷刮酋钮轩穆染姆箩暑扯瓷功批奈陪从鲁泉婉矩第8章维生素B6测定第8章维生素B6测定,