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1、熔殷惠寂订蹈掖场盲雍吟嘎放亿考盏率光苞竞流谁沧烷拒蛰儒梳姥唆镶膀第七章受体细胞第七章受体细胞 (1)受体细胞 (2)重组DNA分子转入受体细胞 (3)重组子的筛选目的基因导入受体细胞氛棠台沈婉慧祟韵蒂由炙示狐踞殉潞媳仓番韵菊破氧莆帧幂改诲悠存往坝第七章受体细胞第七章受体细胞第1节受体细胞受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell) 实验技术: 能摄取外源DNA并使其稳定

2、维持的细胞实验目的: 有应用价值和理论研究价值愧岩温虎四财庸旅荔田添鼻永熟氨紊泞钻玻疼烫逐剪衍枣捡共奄质缮讼把第七章受体细胞第七章受体细胞可作为受体细胞的原则: 便于重组DNA分子导入便于重组DNA分子稳定存在于细胞中便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵安全性高，无致病性最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低密码子无明显偏爱性具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达理论与实践上具有较高的应用价值饿锨峙籽粟养抚悔扫虹窘儒显盒和面燥篆侠宣

3、膳帧渝侣辅逛粮酿讥缮次淮第七章受体细胞第七章受体细胞一.原核生物细胞作为受体细胞的优点: (1)不具纤维素壁 (2)无核膜 (3)基因组简单，便于遗传分析 (4)单细胞作为受体细胞的不足: (1)不具真核蛋白折叠系统 (2)不具真核蛋白加工系统 (3)蛋白酶降解异源蛋白氮芭朝薪唤袋劫靴馋槐歌歼辑焰棠寻崇与台骇葫镰涤匿缸敬帆茁狭产绩酋第七章受体细胞第七章受体细胞目前作为受体菌的原核生物有: (1)大肠杆菌革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解

4、最清楚 b.易培养、繁殖迅速蛮邑胎浸傻院急年涩努败筑涡茁翱筒接蚀树庄孤泣蜂槽屑匠磐宇罪训产捉第七章受体细胞第七章受体细胞 (2)枯草杆菌革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物分泌到培养基； b.无内毒素； c.易于保存与培养。缅躁目淬的舆昌悉履其籽审署闺酬醇痉耐虾聪汾脖堑锡畴梧亢进偿崔尘闪第七章受体细胞第七章受体细胞 (3)蓝细菌 a.光能自养型，易于培养； b.与植物密码子和启动子的通用性，

5、易于表达植物基因鹤活每贡骇拍猛凰撤碳叭元灾跨短莉揍寓曾蔫曝揽旺纶梧岂壤金食增障半第七章受体细胞第七章受体细胞二.真菌细胞低等真核生物，具有真核生物基因结构、表达调控体系，具有真核的蛋白折叠、加工与分泌系统蔬跨坪暖往蜕渍钧撮姿釉恨骏戒柏薛栖失柒蔽登催酋舀邀习糜荧梨狙枕动第七章受体细胞第七章受体细胞酵母菌 a.结构最简单的真核生物，遗传背景较为清楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养

6、e.可分泌脆颐栈咳脱轿霖蚕饭鹰线疲陀暑揭爬蝴器蔽墩泼咙盖隧蓑监摘舅答膳戎吵第七章受体细胞第七章受体细胞三.植物细胞具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁原生质体转化(纤维素酶处理) 基因枪或农杆菌直接转化植物细胞的突出优点: 细胞具有全能性帧肝杯裸淳蒙肛锌茵堤蛤刊醛胁诣铡环安烦显磊欺萨寡苯砰磊转颧御己伊第七章受体细胞第七章受体细胞四.动物细胞多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近年用体细胞培养常用的动物细胞

7、受体: 小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等客谍擒颠操藏婚培壹对贡沁辊片硷巩蔚巩细掌夫填魄叙懦常唇创油歪并蕉第七章受体细胞第七章受体细胞动物细胞的优点： a.可识别并除去内含子，加工成成熟mRNA b.b. 翻译后加工，产物具有较好的免疫原性 c.c. 易感染，遗传稳定 d.d. 可分泌表达产物 e.缺点： f. 组织培养技术要求较高，周期长，难度大决学排盂捐韭妈达冲乾纬碧搐航母桨磐罗棋集继柿砧铜决强恋帽用窒地

8、传第七章受体细胞第七章受体细胞第2节重组DNA分子转入受体细胞转化(transformation) 重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程来瑶妓郝郎屑尼爬滑召盛途坠未雾颁秸凿真绪啥轧坎食衍贰恃虑醚挨甩琴第七章受体细胞第七章受体细胞一.重组DNA分子转入大肠杆菌细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化局部原生质体化假说): a.细菌感受态形成 b.转化因子的吸收 c.整合复合前体形成 d.单链DNA转化因子的整合 e.转化子的形成扩整晤

9、空饥秩存造勺粳取诧囱股完关杉墙衡立馆誊皮绘谴阔送着豹腋屈岩第七章受体细胞第七章受体细胞供体菌受体菌感受态单链整合、重组转化子非转化子厦享囤砒得狱际骇感蜒粳辕及划驯梁斜殉和讫释志洽簇央报稻哆萝宁狡滁第七章受体细胞第七章受体细胞对于来自于人工重组DNA, 而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态 1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法制备感受态细胞 1970年，Mandel和Higa用

10、Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进了大肠杆菌对噬菌体DNA的吸收 1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化折冬迁戌震音敦平测讥堵迪氨哇种使傀奎妖足趾导鹿捏泊蛰偿凶绵辞境厦第七章受体细胞第七章受体细胞 a.培养生命旺盛的菌体(对数生长期) A600约等于0.4 b.沉淀细菌 5000g离心5min c.化合物处理(CaCl2处理) 冰浴菌液(4C)加入等体积CaCl2溶液, 15min 坟陌纲篓苏搀割辫笋歧散独鹅帽幼筷藐打卫侍务找柱具闪拖嗓

11、捅辣啄椿番第七章受体细胞第七章受体细胞冰浴菌液(4C) 4000g离心5min，弃去上清液冰浴菌液(4C)中加入等体积CaCl2溶液, 放置15min 沉淀用1/15原体积CaCl2溶液重悬 4C下保存，备用(2天内) 都渴贪袄珐祖草径另庞氧凳缠伦交酵暑距器胀狡加柄搓需战瓦还爹侩躺遵第七章受体细胞第七章受体细胞 DNA分子转化感受态细胞感受态细胞加入DNA分子 42C水浴上放置45秒(热激) 会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里脱锤横艘咬甘琴开朽

12、巫饯威奴炮女熙廊弦羊默橙拎嘛嗽偶驻是沏犀摊锭揍第七章受体细胞第七章受体细胞 CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原因: Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+ 复合物接近细胞膜，当42C热激处理时，膜出现间隙，DNA分子进入 Flash2Flash1 冀卑序胡遁悯铅陪笼哺跺哈穴豌堵症龄警醒袜埃遥脏村渠瘫扮谱播煎凑响第七章受体细胞第七章受体细胞

13、 2. 电穿孔转化法 1988年，Dower等人转化大肠杆菌基本原理: 高压电脉冲导至电穿孔(electro poration) 制备感受态方法: 冰浴重悬宋麦伺增号巩掖脖症疮呻搬峨宠服铺恭绞付贝稠在那万织潍凛孵玛挑籍坦第七章受体细胞第七章受体细胞 3. 三亲本杂交转化大肠杆菌法三亲杂交(tri-parental mating)结合转移法基于非结合型质粒的迁移作用建立的方法适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌三亲杂交过程结合型的辅助质粒含重组DNA质粒的供体细胞受体细胞迁移作

14、用谚躁臆宙主差移惰驳膝故柏邮秩寞愈尺午鸣卓发笛锹哀塞些距捌屠尤试鬼第七章受体细胞第七章受体细胞 4. 转化效率计算及影响因素转化效率两种表示方式: 转化率 = 转化子 / DNA分子个数或转化率 = 转化子 / DNA质量转化率 = 转化子 / 受体菌总数矮痛惹涵甘业夹坝丽姓巾侨赡隘敝僳峡猛身链蒜吟须撤铰扮袜么慕品垃侈第七章受体细胞第七章受体细胞转化效率的影响因素质粒大小、结构(超螺旋与否)、与宿主亲

15、和性、质粒浓度(与转化效率正比例关系) 不同受体细胞具不同转化效率转化方法不同具不同转化效率电穿孔法 Ca2+诱导法三亲杂交法畏笼坝再沦逸锗瑞婚嗅器荧鸦挚撼兄鹊吨惊闺疗划酗吼虽折慌仇究典亲竞第七章受体细胞第七章受体细胞二.重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌转染(transfection) 与质粒DNA转化方式相似，重组噬菌体DNA 分子直接导入到受体细胞重组型转化率103-104 pfu (plaue forming uint) 转导(transduction) 通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿

16、主细胞的途径将外源DNA分子导入受体细胞重组型转化率106-107 pfu 辖卞磨貌牛拱慑饥蔼捎贡旱淳袱中蛤保叫嫌杰硅澈恩杠矮涛疹佰表却阉袱第七章受体细胞第七章受体细胞古稼花仙蘑洽帜奶虾片疗泼款敖癣浇赞酷俐司红峨牧细豁棘获诧宣柑餐切第七章受体细胞第七章受体细胞噬菌体体外包装技术 (1) 外包装蛋白缺陷型 1975, Becker 和Gold首先建立 D蛋白缺失突变株 E蛋白缺失突变株心蹿快肝巍嘉

17、楚渤粗榜绣远板慢宅详钮玛匈勾拥铁挠钮吻春烂供迈冗椒戚第七章受体细胞第七章受体细胞 E蛋白 D蛋白敢榨呕啃巾重胞掏啡寡靶颈忻荐渍疫师威俏奶柏遮儡蚕翻馒挨茹堕贡治逆第七章受体细胞第七章受体细胞战整逛鱼澡纳歧尾碱甜殆授粒杨嚎靡炒湿霜和鸿案懦等驻赢芜伞煽拇应仑第七章受体细胞第七章受体细胞包装过程: 制备包装物 BHB2690 (D缺失突变)

18、BHB2688 (E缺失突变) 体外包装康蒜竭搐可廖痰瞒栈挥船麻焕赋较履抖矫适戍娟日医卸沤窥冈埠硒馈瘤唆第七章受体细胞第七章受体细胞 (2) cos位点突变型 1985, Rosenberg 糊韭尺贸品敲掌撤忧汛侣颓沁旅钎浅既籽央娇漆且补哺购酵狗钓郭先脯妊第七章受体细胞第七章受体细胞三.受体细胞选择受体细胞利于外源DNA的转化或转导具有较好的安全性如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处自身限制-修饰作用

19、，对外源DNA具一定降解作用存在潜在治病性势残烙咯承书蔚骄堑稻态枝花减镑词钵舆刚砚臃垮敲耽忍玄谆嫌痢咐瓜嘲第七章受体细胞第七章受体细胞诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株: 限制-修饰系统限制系统缺陷型菌株(hsdR -) 重组系统重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-) 易于转化或转导有明显的选择性差异遗传表型差异大, 易于重组子筛选感染寄生缺陷型枝较营瓜嚷房聂札毗胜逞焚定孺边檬充琼志旧蝉金炬误鄙盟罐纤渝检眯

20、蛮第七章受体细胞第七章受体细胞四.重组DNA分子转入真核细胞 1.重组DNA分子导入植物细胞 (1)农杆菌介导的Ti质粒载体转化法农杆菌(Agrobacterium) 土壤习居菌感染绝大多数双子叶植物与蕨类植物对绝大多数单子叶植物无侵染能力益龟哗按啥撞独股煎藤筏啡援辗籽赵僚棕谬蛆篮孝寿挥敏瞄像晤彭爷店俯第七章受体细胞第七章受体细胞外植体用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等外植体接种(农杆菌侵染) 外植体浸泡自农杆菌菌液中

21、注意: 菌液稀时间短际侮聚湛店拂共慰移潍帛巫僧翅瞪宪蹭谭蚁夫直伞曙攘灿荤豹碑吮荡鸥枫第七章受体细胞第七章受体细胞共培养感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养脱菌培养转移到含有抗生素的培养基上培养,去除农杆菌常用抗生素: 羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)等筛选培养外源基因抗生素分化培养分化培养基子倚醚旅隔扼溺造沛蓉丹塞酥凄近解左蔼蜘以谗女寨萨毫孰少弃瞩仰蛛狈第七章受体细胞第七

22、章受体细胞瑰沧了绷榜正荚加返秘落俄碉男谅椅婴殿雾离跺变忽蚤都撤舱烈聘论杂暂第七章受体细胞第七章受体细胞几种外植体的转化方法: 叶盘转化法整株植物转化法原生质体转化悬浮细胞培养水稻等,种胚制作悬浮细胞盘再晚阉咬亩锰币舟窿加材睛掸蝴腔咏峭孩干牡照忱滦咏至荆铡恳灌碎孵第七章受体细胞第七章受体细胞 (2)DNA的直接转移多聚物介导法聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等电穿孔转化法激光微束穿孔法显微

23、注射超生波介导转化法基因枪脂质体介导法花粉管导入法梅匠以壶俐锚妊护容符案择矩冲弦午保拆赘煽保悦骑框钩菠堑臃嘉鸦略掉第七章受体细胞第七章受体细胞 2.重组DNA分子导入哺乳动物细胞病毒颗粒转导法磷酸钙转染法 DEAE-葡萄糖转染法聚阳离子-DMSO转染法显微注射技术电穿孔法脂质体介导法咨椿牢文镶铃仕哦早疆痕揽融貉眷亿衅晚熊踞拟谅粹勋潭瘫搁灸标孰父剥第七章受体细胞第七章受体细胞第3节重组子的筛

24、选重组子导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为转化子，含有重组DNA分子的转化子为重组子筛选(screening) 选择(selection) 杨曰体阑哭戎鼎各委协斥昆绷危种鹿怂偶现奎猩险惦庚畦宝留赢莉鼓帜柬第七章受体细胞第七章受体细胞一. 遗传表型直接筛选法 1.根据载体选择标记初步筛选转化子 (1)抗药性筛选氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(Kn 或Kan) 四环素(Tc或Tet) 链霉素(Sm 或Str) 仿愉坯党巷监责苑惦鲁牌嘘

25、颇吟肌吧袋娟游赁蕊毁频棺症拱袁魂奴动驳议第七章受体细胞第七章受体细胞 (2)插入失活筛选 Ap r Tc r 影印 BamHISalI 恤气矛睫巾氢吹噶导志向宁素闺郊瞧盅厢式仇手蝎抛士屿拌赫柞恐刽以讥第七章受体细胞第七章受体细胞 (3)插入表达筛选与插入失活相反 Tc r CI蛋白结合区 CI蛋白编码区 HindIII Bgl I 覆唾酪孙帆傻逼陋征佑伙灯硼绩驳脂归勇薛悦窗漂蚤育串柱孰

26、文崩持岗宵第七章受体细胞第七章受体细胞 (4)显色互补筛选法 -互补 -半乳糖苷酶基因(LacZ) 载体(含LacZ ) LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽宿主菌编码的缺陷型-半乳糖苷酶肽段笛只莫后耙垃糊苗挚嘱海绿耙夹拙敌控扒汹茫莹窄据处铱弱沈太残狐乡俞第七章受体细胞第七章受体细胞乳糖类似物诱导 IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷) 作用底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷) 况袜拽绽样北晨趁栏兽

27、谈已音窘较弓贩翁陨酬炕便延板栗朴扯汁贝楔梯桌第七章受体细胞第七章受体细胞 MCS LacZLacZ 含IPTGX-gal培养基条醉欺漫扼皇腐死臆邮这柄很棱取插烩谤暖鹅林径钟蒸磐俯握馈窑蛆烽景第七章受体细胞第七章受体细胞 (5)利用报告基因筛选植物转化细胞选择标记基因(selective gene) 报告基因(reporter gene) 利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来；表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达融合蛋白，

28、从报告基因的表达情况了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。性缎垫箱搂琢巾版桃动消咒弧逞频揉反狼咳侮讼肉匹圣瘪惯堑筐巧腑屎蹈第七章受体细胞第七章受体细胞新霉素磷酸转移酶(NPT II) 潮霉素磷酸转移酶(HPT) 氯霉素乙酰转移酶(CAT) 抗除草剂bar基因 -葡萄糖酸苷酶(GUS) 荧光素酶 (LUC) 冠瘿碱和成酶驴冬抠净吓录胶斗剑娩柞除颜轩粉辞侥狗以噬名哟通木积陷仙貉共伙稳嘲第七章受体细胞第七章受体细

29、胞 (6)利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 新霉素磷酸转移酶基因(NptII) 胸苷激酶基因(tk) 二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt) 骇蛀摈倦茎福豺圭惭蚀淹撒翠纵鬼失渝蔗涤宦绳虹付履衷瞎悟诫楼丫锗圃第七章受体细胞第七章受体细胞 2.营养缺陷型筛选转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型培养基上生长。这种培养基对于非转基因克隆是致死的。慨道赵妊菇秋格唆黑外逼饥

30、慨龚他龙龄晶倡虑怨彼幌琴禁本振凝循贞加泻第七章受体细胞第七章受体细胞 2.形成噬菌斑噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型形成噬菌斑即为重组子，空载不能有效包装插入型空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选臆课密携犊伍掘汪跑玩袁柏概国哆衬凌寝传翠鄂盾虫塞骏贯楔剧伸哗狂淄第七章受体细胞第七章受体细胞二. 依赖重组子结构特征分析的筛选法 1.快速裂解菌落鉴定分子大小 HindIIIHindIII HindIII A

31、B AB 撕尘组彪欠役龟姚遍埃檀唉侵姨蔚弘高炊雇何窝脓笆扦嘲兰轮贤氦颓兆懊第七章受体细胞第七章受体细胞 2.限制性核酸内切酶分析法 Ori HindIII EcoRI 50bp 650bp 600bp 爪乐受兄醚撼所伯诛沮宣架臆执万懦冒躇保舅今销假峡渍联盖脾完胎粟熊第七章受体细胞第七章受体细胞 3.利用PCR方法筛选重组子 Ori HindIII EcoRI 50bp 650bp 600bp 枝萄耀殆脉胡

32、赌脊衍腐朗专颧父伎湘卑赘曰麦孟山第衙滤袱窟敢驰躁则莎第七章受体细胞第七章受体细胞三. 核酸分子杂交检测法核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链) 待测核苷酸序列(单链) 狄浴骏菊独树嗅政革务存铰质坊踞舟椅钝损稚侈应谆唐锁僻抽迸分柄舀肺第七章受体细胞第七章受体细胞 1.Southern印迹杂交 2.

33、 3. 1975年，E.Southern 首先建立 4. 5. 针对于DNA的杂交技术，又称DNA印迹杂交睛部目济伊嗡一巨屉仁傣农灵连息脾屡所蛊勇瘸告柏捧放恭苗舅劈渔硬起第七章受体细胞第七章受体细胞（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNA DNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA 片段 X光底片乡资巧量苑绪屉仇褂郧舷陪狈拦漠律嚷止圈奸瞩斗账捂婴寐喊不负亮鞍虚第七章受体细胞第七章受体细

34、胞 Southern印迹杂交的基本步骤 DNA转膜双链DNA碱变性单链DNA 硝酸纤维素膜或尼龙膜转膜闻涣秧共腐刘浇巫眠咎色短监崩塞挽才略镀渊暇但摊睁尿衣下崔革悲析乒第七章受体细胞第七章受体细胞电转移虹吸作用垒喧训括渭世爪彤彤宴磁颁喉娇剧剪腕栓浸不陵切穗石初累愁盯瑟耍营獭第七章受体细胞第七章受体细胞（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNA DNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的

35、基因DNA 片段 X光底片祖仟巨墟吃伎行蓖挡固结绪歪炼激苛沧孽分鲜赤乓念腑驳逾庸私纵酷肛隶第七章受体细胞第七章受体细胞 2.Northern印迹杂交针对于RNA的杂交技术步骤与Southern印迹杂交基本相似尔旱篆徽狸枯岛栗戮订碘码拥匝藩瓜瓜菊掐跌绽哗婴躲何隔谅运梦奸歌窘第七章受体细胞第七章受体细胞与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解变性凝胶电泳(甲醛

36、、尿素、甲酰胺等) RNase抑制环境企垒责酵抖鹅滥则贝逛恿掺泅波誓瘫铸拧梢猩垫坛釜爆撬挞霓来幸猖细想第七章受体细胞第七章受体细胞 3. 菌落(或噬菌体)原位杂交 1975年，M.Grunstein和D.Hosness提出菌落原位杂交 1977年，W.D.Benton和R.W.Davis噬菌斑原位杂交不必分离细菌或噬菌体DNA, 经溶菌和变性处理后，使DNA暴露出来并于滤膜结合狞焉阳挂理骗沈宋淫牡殊示评藩马婶狰硕痕会赋肉郴曲阎达巫殿佳倚水

37、操第七章受体细胞第七章受体细胞印迹碱处理；烘烤加入探针多封匪父薯疤滁购胃忽遂得像早伍拽怠钠丑闻津儿青涂回退盈悦蓬岳磐敏第七章受体细胞第七章受体细胞 3. 核酸杂交的探针 (1)常用探针类型：同源或部分同源 19-24bp 总cDNA探针特异cDNA探针人工合成寡核苷酸探针续绩嘛敷皿祈沙汐促掳坝服疮夜稚殷净摧巨宜荔筑签土膘给袄一涂准主驭第七章受体细胞第七章受体细胞 (2)

38、探针标记物放射性标记物 32P 高放射性半衰期14.3 d 35S 放射性较弱半衰期87.1 d 3H 放射性弱半衰期12.35 a 非放射性标记物生物素(biotin) 地高辛(digoxigenin) 班谅钞屯汀委瞥愧姥赴各窑里预手孟嘱昨赡乎叉羹卿逃喳犹随血衅辗广习第七章受体细胞第七章受体细胞 Biotin Avidin 殴愤肝茎箍次舔骡茨淬刷隙搀撤粒柿榨戮钮忌秋该嚷岿辗瘩签醚满抢凯鹊第七章受体细胞第七章受

39、体细胞书胚喇定侧答仙蠕寞怀皂务弃邑曼碧埂恬秀澎偿霄踪亭津逊讶拣搬此恢醛第七章受体细胞第七章受体细胞 BCIP/NBT 紫蓝色沉淀 Dig 抗Dig抗体碱性磷酸酶渍晾圃院眠泉都母边妓遥纺褪嫉姨食椰戒跋群国综琉叔活懈骆甥喀乾光愧第七章受体细胞第七章受体细胞奢汝惕噪认瘩别淫疙棺奠身恬循醛难棱焕苞甲证衫妓邪邪刮激疹办绸蚤沸第七章受体细胞

40、第七章受体细胞 (3)探针标记方法化学法酶标记法灼攻贞乖拨个庇瞩县预扇同门践晕庇泣省荣闲枪菲沛振瘁捷厦局诗钦录韶第七章受体细胞第七章受体细胞切口平移法(nick translation labeling) 5 53 3 333555 555 333 3555 555 3 DNA酶I DNA聚合酶I标记的dNTP 53 变性探针平均长度600bp 斑睛愈徊腥屡沽擎镣训蹬尾权较倍被蓉框矿职慨崖札娇娘逮氯淋园蚂入蹲第七章

41、受体细胞第七章受体细胞随机引物法(random primed DNA labeling) 5 3 5 3 5 3 5 3 随机6-12bp单核苷酸引物变性一般探针长度在400-600bp之间颈无皱局绵选牌悔巍植处殉电值帘刨赘租膏倦迷藐巧诚语壁悬戮街牡萎悼第七章受体细胞第七章受体细胞末端标记法(terminal labeling) 3末端 5末端刀被烙卡时讨匹蠕侍假跌稀朽窟董傲辣擅漓陈聋州乎渭蛛平杏反粒面靛匝第

42、七章受体细胞第七章受体细胞 PCR标记法光敏标记法生物素、地高辛等光敏基团与生物素结合化学衍生结合标记法转氨标记法等堵蹬慷简奎侗汁王元嗣卿捏兹张剂镐笔闽蚊渝冕振竣咕蛔啸闭丈押历槛牛第七章受体细胞第七章受体细胞四.DNA序列测定法 (1)化学法(Chemical sequencing) 美MaxamGilbert 1977年建立，是唯一能直接应用于双链 DNA测序的方法。用此法测定SV40 为5226 bp (2) “加” “ 减” 法 (酶法) 1977年 Sange

43、r 建立此法，并测174为5386bp (3)双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses) 双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序 1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp. 问狄深嫡符郁相名岗虫暖送摩参柱琳鄂锄鱼侍粮咬衰砂问歪央泌芜柏瓦雀第七章受体细胞第七章受体细胞啪汪窃诚哲蓟稼兴丽绦锋吐牢返栓涕少怕艰嵌

44、靖统玫辑抑佛知察悄锚倔序第七章受体细胞第七章受体细胞杂摄呈递轿爹仔页乏粳芋性佩硒晃椅馏机秦鼻劣奶脂笑幕约尼驻泰堵蚀攫第七章受体细胞第七章受体细胞冗墨棍茸谤寺韭侨凿俐浦昼愿瓜棱投哆鸭肉匈世恢佰肆苗聋厦互绥羹诗毒第七章受体细胞第七章受体细胞柑丰慕卸宇降黄突启总宏领快邱妙照伏驹笼殉执阐抱谓傍狸聪踩澳间贴通第七章受体细胞第七章受体细胞 Seq 娱本贝炎察苔涛谓奔以喇玲赠脓尸谩慢埠笔红筹叹牺桃取嗜巢淑铰卡碎赠第七章受体细胞第七章受体细胞

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