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1、第四章基因工程的主要技术及其原理,蚤脆揍欺厩琼尤铡榔腹创宠砧护运苦斤验酣岁嗽置绞措炬帜关碘肆偷烈迢第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,第一节DNA和RNA的提取与纯化,制备纯的高分子量的DNA 是基因工程操作的基础之一,宾娄前屠倘亲逛牢上时摸凌坍出教蒋靴缴抓赋踪熟罢蔓展迄矣粒裸缴诧肮第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,一、DNA提取的基本原理与方法,化学性质,比较稳定,潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接。它的碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。,1. DNA的性质：,成统魁呢
2、煌佛杰萎谁爪忧患染趾剃窗善椭泄蛆吸赡咀孙粘往样距凳僻倍有第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,核苷,核苷酸,碱基,荆跟猿缴匹槛西栅痊夹辈坚饱聊诵砸钞袄炬早医侩伤源囊脉耘掳逃择晰庭第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基堆积力和DNA骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得黏滞。 由吸液，振荡，搅拌所导致的水流对黏滞的盘绕物产生拖拉力，能切断DNA的双链。DNA分子越长，断裂所需的力越弱。因此，基因组DNA容易成片段地获得，
3、所需分子质量越大，获得的难度也相应增加。,物理性质,店掩再唆钢涉幸弊档野病肉笋深笑昨瓶蜀冉荐抑汤湾颈美淘匙赚董榨竹箔第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2. 天然DNA的来源和用途,天然DNA包括染色体DNA,病毒DNA(噬菌体DNA),质粒DNA,线粒体及叶绿体DNA等,可从不同的生物体中提取.,卿锻页诛扎枷缓助盟轿缴瑶窖送竞政闹危企技倔森盒阳服叛淖席颖盗南幂第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA. 其分子巨大,可长达106kb,小的也有1000kb左右.是生物界含量最丰富的DNA资源,蕴
4、藏着地球上极大部分的遗传信息. 是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料,也可提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统之用.,病毒和噬菌体DNA. 含DNA的病毒和噬菌体的种类很多,能在相应的原核生物和真核生物宿主细胞内大量增殖.由于此类DNA可被体外包装,所以主要用于构建基因克隆载体,承载较大片段的外源DNA,经体外包装,导入受体细胞.此类DNA也编码一些结构基因,可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料.,熬揍镊扣单刺镶惋穗幻躺明腺蹬望向馈代墨竟洒就吕境辆输斧宰学主稀颖第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,质粒DNA 很多微生物细胞内含有质粒DNA,游离于
5、细胞质中,所以被称为染色体外遗传物质.每种质粒都有复制起始位点,能自我复制.主要用于构建载体.也要用于分离目的基因和基因表达调控因子.,线粒体和叶绿体DNA. 真核生物特有的染色体外遗传物质,分别含有与呼吸作用和光合作用有关的基因.可用于分离目的基因及构建载体,焊碴顷甲溃坞病率国丈鸡始吃词端觅背傅褐冗专急浆念刃曙菜掖情耍鼠傈第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，
6、 以获得可用的DNA大分子。,虐悟卸多胶链蜗拯奔休限咆件上迂矮世杀据芭健撵斑篓绣懊碴肤砂澎青湘第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,（一）DNA提取的基本原理 DNA分子是极性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离太更易溶于水。 酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 生物细胞中大部分DNA集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响，0.14 mol/L NaCl溶液中最低，仅为水中溶解度的1%，浓度升高，溶解度增加，到1 mol/L时，比纯水高2倍。而核糖核蛋白(RNP)在盐
7、溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14 mol/L NaCl的溶解度较大。据此，可分享DNP和RNP.,壕湃议饶荷奸跺七胖水擒掺垫懦吹羞歌陪矗弗篡耻氯王润孩宗钝恨滑骨沪第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,一般DNA提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及溶解DNA，接着采用几种化学和酶学方法中的任一种， 以去除蛋白、RNA及其它的大分子。,容婆夫叛拒胞派厘败堑蛛收洒撂桐袖饯邦蚜替芥拭瘸愁拐蹿笑错住匣扩魏第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,1生物材料的准备 选用的材料应该是处于提取DNA得率最高的生长期,或者是DNA容易提取和含
8、量高的组织.对于细菌,一般取对数生长后期.对于植物一般取幼嫩的植株,并且暗培养1-2天,甚至黄化苗.提取动物肝脏DNA应清除胆囊,因其含有多种高活性酶.,呀认镭舆责哟到涨掩覆殖蛹粘佯粕几峙啪谱垒怂它遏肃材领邑卉览频停聪第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2细胞的裂解和DNA的溶解 细胞不裂解,则DNA释放不出来.裂解不完全,得率就低.如果细胞裂解过于激烈,会导致DNA的断裂.裂解方法因物种而异. 对于原核生物,可用溶菌酶处理.用NaOH,SDS,用煮沸及冰冻,超声波处理等方法使细胞裂解.,跑圭污迅缸囊镍触谋习紫颗初苑辈赞匠劣束由懦燃抽次感讨国摹柜沈藤涪第一节DNA
9、和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,对结构复杂的动植物材料要进行磨样(粉碎)。一般方法是将材料放入研钵（放在冰中预冷），加入液氮，快速磨碎成粉状。然后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞. 一般用SDS、CTAB、溶菌酶和蛋白酶K来裂解细胞。 所用缓冲液一般为TE（TrisC-HCl EDTA）缓冲液。 提取缓冲液：100mmol/L Tris Cl(pH8.0),50mmol/L EDTA (pH8.0),500mmol/L NaCl,10mmol/L 巯基乙醇。 在提取时，将10SDS加入缓冲液中于65预热一定时间。然后加入到装有样品的离心管中，于65保温6090min。
10、其间轻轻摇动数次。 4下12000rpm离心10min,将上清转入另一离心管中,上清即为DNA的粗提物。,蜀房米孔宦申冤伎仙毖美琅松浑护贴渍鹊庆棕船货煎朝瓶臣柒爬蚂搔毁桓第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,正常条件下，由于细胞的区室化隔离，DNA酶，氧化酶等分布于特定 区隔中，不与DNA接触。细胞破碎，则容易导致DA N降解。 因此提取过程中对DNA 的保护显得非常重要。 措施： （）利用液氮超低温下研磨，减少损失。 （）快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。 加入EDTA和抗氧化剂及PVP等,舍欣篓妄疗缆残产江果杖竞不侮儿叫绚狠澡送仟冶槐基袜贪纠
11、坏家徊见邢第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,3核酸的纯化 主要根据核酸的性质,使其与细胞内其它成分分离开来,从中进一步抽提DNA.（杂质的去除） 核酸通过有机溶剂抽提并进行纯化。污染的RNA通过RNase消化清除。 在粗提物中加入等体积的氯仿异戊醇（或酚氯仿异戊醇）轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min，上清液为DNA的水溶液，根据需要，还可以重复这一步或用氯仿/异戊醇颠倒混匀再离心. 此过程目的是用酚和氯仿去除蛋白质。,馋泞荷必陵狂瞥罪邦蔽汞迪停脚孟钝好撑屎司涩妥质诗牌肺粤忽韦憾齿殆第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,在提取D
12、NA时有机溶剂的使用,酚和氯仿为非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚和氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。,辱遣迟规垫血林偶敬穴监跳巢邵资羹瓣殖椅谤端奖陌貌命音息生厕出众袜第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,作为表面变性的酚和氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊. 酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而
13、氯仿变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合使用。,硼齿攘馏孵则加柳淌储瓤贰盯荡开种锑赊筹钳琵缩磋妊腐赣缅泊扫秘付茅第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,在抽提DNA时，为了混合均匀，必须振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为24：1，也可采用酚、氯仿与
14、异戊醇之比为25：24：1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,酚的平衡和饱和 酚的饱和： 因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其在抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris 调节其PH值到8.0称为酚的平衡，其原因是DNA分子在此条件下，比较稳定。,樟遁娱因饮论山悠扣锥由除壬啊浸站觅骤屈人焕艘菏抢珐坟构沸翰碧务鸟第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,4 沉淀DNA 用无水乙醇（异丙醇）沉淀DNA， 这是实
15、验中最常用的方法。 具体方法是将上面所提的上清液加入2倍体积的无水乙醇和0.2-0.4 mol/L的NaCl，颠倒混匀，冰冻30min. 可以观察到絮状的沉淀,即为DNA，经离心，除去上清液。 DNA溶液是DNA以水合状态存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。也可改用95乙醇来替代无水乙醇（价格考虑）。,隘担江腥仔照驮桶亦泄厦扯捞们寨耸蓄末颊抓魂倾架武买权惫厕出若善灭第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,在PH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷
16、的，加一定浓度的NaAc或NaCL,使Na离子中和DNA分子上的负电荷, 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力, 易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，因为过多的盐杂质杂在，影响DNA的酶切等后续反应。,严枉避壹碎住蚊蚤涕支炮勒务捌斋吏肩翌语薯翱拦亥鱼纂夫燎欢潮冻商街第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,5 DNA的溶解和贮存 回收的DNA沉淀在溶解以前须在实验台上敞口放置一段时间，使残余的乙醇挥发掉（或真空抽干），然后加入适当体积的TE缓冲液，
17、使DNA溶解。DNA的TE溶液贮存于超低温冰箱（长时间）或20冰箱。,惊蹋抹芋串驳腐汇旨阔沼迈淋五宋吩纂颖攫个纸渭鲸镑邮咐卜娠伸求蒋粉第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,(二 )DNA提取的几种方法 根据细胞破碎后，分离DNA 与蛋白质所采用的技术策略 不同，可分为以下几种： 1浓盐法 原理：RNP和DNA在电解溶液中溶解度不同，从而分离。 方法：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP黏液中加入含有 少量辛醇的氯仿一起揺荡，使之乳化，再离心，使蛋白质 凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA 位于上层水相中。 回收水相，用2倍体积95% 乙醇可将DNA 钠盐沉淀出
18、来。,中姑韩粳诚弟伟琶阮逊厚面甫旁嚎琼串金艳书唱乖楚参旱盒见惊靶冻琼诣第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2.SDS法 细胞破碎后，加入SDS使细胞膜裂解，并同时使蛋白 质变性，将蛋白质和多糖等杂质与DNA 分开，加入 乙酸钾，可使SDS-蛋白质复合物转变成溶解度更小的 钾盐形式，沉淀更加完全。 3.CTAB法 细胞破碎后，加入CTAB分离缓冲液，将DNA 溶解出来 再经氯仿异戊醇抽提，除去蛋白，得到DNA,岳能雁批锭动腮蚀驻互波卯隙牙奶泛雇社蒙试司礁写莽样冈撵损涯屹映菱第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,4.苯酚抽提法 苯酚作为蛋白
19、变性剂，同时可抑制DNA 酶的降解作用。苯酚处理后，蛋白质分子溶于酚相，而DNA 溶于水相，离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并水相，用乙醇沉淀DNA. 5.水抽提法 利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中，使DNA 充分溶解于水中，离心后收集上清液，在上清中加入NaCl调节至2.6 mol/L，加入2倍体积的95%乙醇，立即用搅拌法搅出，然后用不同浓度的乙醇洗涤。空气干燥。,郁援荐驼挎捐透街顽谜很褪想元铅氏臆诀剂矽篙蛾六簇奔椰挑粮低疽踪捉第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,有多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，无一例
20、外都包括以下 三个步骤： 培养细菌 氯霉素的加入 收集和裂解离心 寄主细胞裂解：可采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂 或碱处理及加热处理等。根据质粒大小、菌株和裂解后用于 纯化质粒DNA的技术，采用不同的方法。 用溶菌酶或十二烷基硫酸钠（）,(三）质粒的提取,质粒的提取是基因工程研究中经常性的工作。,豺营忧浩滓聚蔓纂司布冈宵釜项锥罩蜀套炳塑疤弹彭喜靡厌轻匆缠躁缮犁第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,纯化质粒DNA 染色体分子以高分子量的形式释放，可用高速度心方法除去得到清裂解液。但仍然会含有相当数量的片段化的染色体分子。因此必须进行纯化。,汝众骨嗅壬虹垒僚假咎拦
21、坐筒墨出渍蹦喷也咋坍帛缆瓷醚陇锄铰悬咬葬倾第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,铯是55号元素，由Wihelm Bunsen于1855年发现。由于铯原子很 重，CsCl的浓缩液在高速离心数小时后即可形成密度梯度。大分 子物质的浮力密度如与密度梯度中某一位置的CsCl浓度相符，大 分子物质就会准确地漂浮在这一位置上. 离心管中CsCl起始溶液的密度通常要进行调整,使其与有待研究的 分子或颗粒的密度相对应。 如多数双链线状DNA分子的浮力密度约为1.70g/ml,形成梯度 的CsCl溶液的起始密度应为1.70g/ml,1氯化铯密度梯度离心法,玲踏瘁怒始透奉婆波勺龙末辈阵
22、简钉坡体狮茧卓侩俯饵劳钻病和汾镑洼须第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,细胞裂解及分离过程中，大分子量的细菌染色体容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒 则由于其分子量较少，结构紧密，所以仍保持完整状态。根据此差别进行密度梯度离心纯化。,点孙达妄晤仟倾峪包埋铱终撤扭称擦咆市靠抑廷捕腊酝抬澡氟造彤婉烩悦第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,利用在浓缩的盐溶液中，溴化乙锭（EB)扁平分子在碱基对之间的嵌入作用。 染色体分子线性片段具有游离的末端而易于解旋，可结合大量的EB分子。而质粒的共价闭合环状的 分子，由于没有游离末端，只能发生有限的解
23、旋反应，结合分子的数量少。分子结合数量越多，则密度越小。密度梯度离心后，处于不同的位置，从而达到纯化质粒之目的。,胃掐蹦赔歹瘩烘调涧饥眉蹲黍喂恰护淬掳撒亮糯驶学毗钻亩眶椅除急群传第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,权驮稽忌牲没婶钨奸虹氓识腰驰枪凸吃舒浸蹋抹瞧镭页瑰扬懊茸列探逾衙第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,沟珐埂豪卜蛊粮蟹大狂吏瑰炸柬磺搭狗冻黎值卵详档当送发积章咨懂怂厕第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2碱变性抽提法 染色体DNA为线性DNA分子，质粒DNA为超螺旋共价闭合环状 DNA. 根据共价
24、闭合环状质粒与线性染色体片段之间 在拓扑学的差异而发展出来的。 通过加热，尤其在pH值介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性的 会被变性，而cccDNA则不会变性。 即根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达 到分离目的。,辞兜驰崖员栗刺倾之挫釜母浑跟阮拧卢叔馋波深船钎貉宜吩礁立喻战荔惟第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,变性处理过的质粒和染色体混合物，通过致冷或恢复中性pH，便会迅速地复性。在复性过程中，两种构型的分子，其双链再结合的精确性有本质上的差别，所以复性快而准确。而随机断裂产生的线性的染色体分子，彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不
25、会迅速。常聚集成网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及一道沉淀下来。从而分离。,汕笼向圣播杜啄识陪朝升实宿循族髓并卤裙獭袭禄偿拔光吴腺逻偷籍币步第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,碱变性法一般要用到三种溶液即: 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部 EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉 . Tris-Cl 控制溶液的pH 溶液II，新鲜的0.4 N的NaOH和1的SDS等体积混合 ； 新鲜的NaOH,是为了保证NaOH没
26、有吸收空气中的CO2而减弱了碱性 这一步要注意: 第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦.,厩箭障然拽疚呐弟闪蛹褒滞祈疗肿止嘲赃停奇惩啼裹盗尺尼设慌吗连泊记第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀. SDS专门和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合
27、一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。 2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了 .,溶液III，3M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液III加入后就会有大量的沉淀 .,椽苛绿在袭冈悍棺施技臣煽右阁鞘蓑到拳庆亿昔游奇吹锐蔓樱巾搂满梗傲第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,3影响质粒产量的因素,1.寄主菌株的遗传背景,使用endA基因突变的菌株，失去了合成具有功能活
28、性的 核酸内切酶能力，从而增进所含有的质粒分子 的稳定性。,2.质粒的拷贝数及分子大小 理论产量=质粒拷贝数*分子量大小 *每亳升培养液中的大肠杆菌细胞总数,铝利泉醉搞挪慨委馈绘奏撰猪恃谨惧以按蒋切邑捅卯揽痪鸥魏剧净办镣沤第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,RNA性质与结构 核糖核酸。 因为核糖残基在2 带有羟基, 所以RNA比DNA的化学性质活跃, 易被污染的RNA酶（具有水解核糖残基和磷酸二酯键能力的酶）切割。,二、 RNA提取的基本原理与方法,（一）总RNA提取的原理与方法,1.总RNA提取的原理,巾捡嫡懈篱优朱深苛涪楷仲泛薛峨财彩燕颜锋眉妖奎握杀扩剐远唁笋
29、惕弛第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,(1) 单链状，但许多区域可自身进行碱基配对，形成回折。,涛揭蛀纂段末湖复幕傈魁嫡馁血恿版贩忽煞青分砧钻逐耐旧浆瑰介懊掉猪第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,(2) 碱基配对规则：A-U，G-C，不能配对区域形成突起。,(3) RNA分子比DNA分子小得多，一般含几十至几千个核苷酸,核苷酸之间的连结方式：3,5-磷酸二酯键,玛预碳乒随享迸柒升瞧渍咖霸企苟偶痊淮征吹冤挖角塌肪坍恢恤匡北袜八第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,提取RNA 的关键 分离纯化完整的mRNAS
30、是进行分子克隆和基因表达分析 的基础，真核生物RNA分子方要分布于细胞质和核仁，其中 mRNA占总RNA的1-5%，分子量大小不一，多数与蛋白质结 合成核蛋白体的形式存在。 能否成功地提取真核生物的RNA,关键在于能否完全抑制或 除去RNA酶活性，分离获得全长RNA。,废给疵五颐悯央唾役锁钠驻黄些愈梅布鲤疯杨琵圾厨辟瓷极蔼针帽赦凄痒第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,RNA酶的特点 (1)RNA酶的稳定性 由于RNA酶链内二硫键的存在，使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。所以RNA酶很稳定。 (2)RNA酶分布的广泛性 RNA
31、酶是所有生物生存所必须的酶.玻璃器皿、操作平台、以及浮尘中,人类的身体表面都有。,臃言爵阔勿恳掸彰镜咨膳裹桔舰弹厚德别聪复按蒋糖嗜构嚼四幌榜哥牌棕第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,(3)RNA酶的活性 和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被缓冲溶液中加入的EDTA或其他金属离子螯合剂失活。 所以在提取RNA时，防止RNA酶的降解是最重要的环节。防止RNA酶的最好办法就是在第一步即避免污染。,且胯蔼候祖辽波壶主像轩惰吃迅煌售搞潜滨凯疤仅震流呛羡痊熊聚送孩茄第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,外源性的RNA酶通常
32、有两个来源： （1）被污染的缓冲液：由于粗心的无菌操作，使缓冲液被细菌或其他的微生物污染。不能通过高压灭菌而除去，被污染的溶液或怀疑可能污染的溶液必须丢弃。 （2）移液装置：如果自动移液器以前被用来分配含有RNA酶的溶液，那么使用一次性没有RNA酶的移液器头已经没有意义。如果移液器枪管或金属枪栓与试管的边缘接触，它就成了非常有效的散布RNA酶的载体。,错噶抹鸳妮伊枪卸戴盛衰蔼御衅各誉宇犀瑟佬句滁禾豹兴究局笑蝎琳盒屹第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,进行RNA操作时，为了防止RNA酶，所采取的措施包括： （1）仪器和缓冲液专用，如移液器，电泳槽、玻璃器皿、塑料制品
33、和缓冲液。对于移液器，用声誉好的厂家证明无RNA酶的一次性移液器枪头和微量离心管。为了减少污染的机会，当从原包装取出这些小的器具放到实验室架子上时最好用无菌的镊子。所用的溶液以及玻璃器皿以及电泳装置等都要用RNA酶抑制剂进行处理。 （2）在分离RNA的过程中，用抑制剂以抑制RNA酶的活性。,悟麻骡渠漠庶栅焉渝氰普删版家蜀柜倚钙昂色夷写责撮虎视冤贝巩五晶捷第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,RNA酶的抑制剂类型,焦碳酸二乙酯（DEPC） 是一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNA酶的活性。用来灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNA酶。,氧钒核糖核苷复合物
34、 能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性。因为该复合物不能共价修饰RNA酶，因此在提取纯化RNA的各个步骤中都必须应用。由于该复合物强烈抑制RNA聚合酶和RNA在体外的翻译，因此必须用0.1%的羟基喹啉的苯酚多次抽提以从最终产物中除去。,与词咽鳞澄员蜕腊仍罐枫珠漫恶啮完北极瓦诊钎寥夫蚂唾搭厌虏蚜钻恢床第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,RNA酶的蛋白质抑制剂 这类蛋白质可以与RNA酶非共价的结合，形成复合物从而使RNA酶失活。 不同商家出售的商业名称不同，如RNAsin,Promega,Prime Inhibitor,5 Prime3 Pr
35、imer等。由于它们不能在变性剂如SDS和胍存在时使用，所以在裂解细胞时，不能加此类蛋白。但在随后的纯化RNA的所有步骤中均可使用。由于可以被抽提用的苯酚除去，所以在纯化过程中需补充几次抑制剂。,同嫡导龙惹帛河曝琶傣霄致态耗双脾展狮亡适动溉冉跃锨槛脸匡堕选哎何第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,提取RNA的关键点： 细胞的有效破碎 使核蛋白复合体充分变性，解离，使核酸释放到溶液中。 有效的抑制RNA酶的活性 将RNA和DNA、蛋白质和多糖分开。 方法： （）先提总核酸，然后用氯化锂将RNA沉淀出来。 （）直接在酸性条件下酚氯仿混合液抽提，低pH的酚将 使RNA进入
36、水相，使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分开。 水相中的RNA分子用异丙醇沉淀浓缩，然后复溶于异硫氰酸胍 溶液中，再用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀， 即可去除所有残留的蛋白质与无机盐。,谣浮蚁亿肃洼擞颓符群休奇绎喳策垃渝普橱粱漆搁络帝鄙笑窿实猛担囚牛第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,RNA的贮存 用去离子甲酰胺溶解并贮存于20。,观嘻直蓟目态离滑嘶暂颐属擦弛先诉党棚妆蜀匆努辉镶贰浇瞩遏烛盂淬锚第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2. 总RNA的提取方法 酚异硫氰酸胍(GIT)提取法 原理如下：GIT与巯基乙醇共同作用抑制
37、RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高,完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。 离心分离法 利用RNA吸附硅胶或玻璃质离心管代替有同溶剂提取步骤，可避免有机溶剂的损伤。如Qiagen公司开发设计的试剂 盒 .,搔值核笛骚趴性刃颇狸撑烁陛迎唬推笔玫亲伶宇术攫睬号插讳胺惧粉掐官第一节DNA和RNA
38、的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,（二）mRNA的提取,1、RNA的种类及其结构,籍荒才拯锗庸屉颖仆郁症纯栏茵宽肤铅贫漆抉陋馅需闹尧暴蠢式丙朱浓乾第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,tRNA分子,功能：tRNA：转运RNA，负责运送氨基酸,谩蔬篙若矗榴瓜倪图琢惟瞎篮焚驮脚倪挫绸酱腊吱噪秤录卜车厩骨果痢蹲第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,tRNA分子,特点：,数百种，分子量小，只有73-93个核苷酸组成，主要特点为含稀有核苷。,有较多的修饰成分,摔街库企针众粹节愤凳漏技尖轻扰纹芭框卵佃统患虹灰曹侮忆促庭横大褐第一节DNA和
39、RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,A-U，G-C碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。四臂四环。,3端都为CCA，用以接受氨基酸，叫叶柄； 5端都为pG,有十几个恒定的核苷酸，对于维持其空间结构和实现生物功能起重要作用,tRNA分子,闭儒嘉多哪袒孝闭捆牲赛呕魂登禾神藻衡嫡缸茅合邦绣扳沪菇乍本烈剧捆第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,A-U，G-C碱基对双螺旋区为臂，其它区域为环。四臂四环。,3端都为CCA，用以接受氨基酸，叫叶柄； 5端都为pG,有较多的修饰成分,tRNA分子,婉鲸卫鲤薛靡踏禾啄勒坟熔尾暑粹瑰食委洛粥簧共腥君饼批津赢规甲守彤第一节DN
40、A和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,反密码环由7个核苷酸组成，有3个反密码子,可变环，由3-18核苷酸组成,二氢尿嘧啶(D环),tRNA分子,TC(为假尿苷),谚倚含赘铃虹救新厌犀痘快价藻琅扳栓茎起眺坠内黔项扎妄汹籽睛份腹靴第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,3、tRNA的三级结构,倒L型：一端是CCA，另一端是反密码子环。,二级结构：三叶草形 四环 二氢尿嘧啶环（D环）、反密码环、额外环、TC环 四臂 氨基酸臂、二氢尿嘧啶臂、反密码臂、TC臂,结构为行使功能提供基础,tRNA分子,椭不查淆竹刁侮覆学型桑缨稠市失体撂樱蚕委惰谤毛县选袭旅棱数犯澈
41、锦第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,肚辆圆戳歼剪胞屈报瘦徽酣膊鲸家掺莲惜送诉邮央惨虽康涪柔荣德轰眩标第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,rRNA分子,占细胞内总RNA的80左右，由120-5000个核苷酸组成，但种类很少，只有3-4种。,热迈芬恢俊惋涛庇幂拴激绘帽绽耕羊咖奋碴膨蛰融贞愚间赋晋伦典馈躯缴第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,rRNA分子结构特点,与蛋白质结合，组成大小亚基。,具有酶功能，如核酶。,合成蛋白质的场所。,二级结构可形成茎环结构。,遏凛黄落搭哆肋香换跋蛙氖荣昧居稽怀力靖绝盒逞响段遭
42、叹竹擞峻扁袁街第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,也呈茎环结构,大肠杆菌 5S rRNA 的二级结构模型,rRNA分子,懦镜规荆渊狗拧伸痢类宣笆孽嗣高艾兑字龙罕解矿仁琢椒忽踢巫辐汤猖泄第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,大肠杆菌 5S rRNA 的三级结构模型,rRNA分子,搏尝饱疚畏浆飘学涌胞揩牢闻列棍道耶邢军浇谊短杰挨齿铃嘴淫素很闰癸第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,mRNA分子,原核生物和真核生物的mRNA在结构上有所不同：,1) 原核生物的mRNA是多顺反子的，真核生物的mRNA是单顺反子的；,
43、2) 原核mRNA 5端无帽子结构，真核mRNA 5端有一段帽子结构（m7GpppNmpNmp-）；,3) 原核mRNA 3端无PolyA，真核mRNA 3端有PolyA。,础股祭眺揍蹿助董酒磊闷劲惑虚蹄塔凭究控嚏招凸畏租连旱论句啥邓霹富第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,mRNA分子,含量少，单链分子大小不一，也能形成茎环结构。,mRNA是蛋白质生物合成的模板。,每一种蛋白质都有对应的mRNA，种类多。,豹厕蕊侮宿庶湿氦驭劫撂砒周睡凉浮继篙房蒂疚澎张灿肢磐荣炎片它敦饺第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2、真核生物mRNA的分离,（
44、1)得到总RNA后，可用oligo(dT)-纤维素层析法提取mRNApoly(A)+RNA . 其原理是大多数真核mRNA 3端带有足够长的多聚腺苷酸残基，可通过其与挂有寡聚d(T)的纤维素亲和形成稳定的RNADNA杂合链，不含polyA的RNA从介质中洗去后，应用低盐缓冲液解离双链结构，并从介质中洗脱poly(A)+RNA, 从而使mRNA得以纯化。这些相异的mRNA分子合起来，实际上编码了细胞内所有的多肽。有柱层析的方法和批量层析两种。,拎食盂易真果斟子漂防替裤容肠砂灵但净舔衫蝴膨倔娠惮傀俊蹄胡品烹珠第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,（2)提取mRNA的另一
45、种方法是包被抗生素蛋白链菌素的聚乙烯磁珠法 其优点是可以直接从含异硫氰胍的裂解液中分离mRNA。 在典型的实验中，组织、细胞或细胞悬液用硫氰胍裂解，将带生物素的oligo（dT）引物直接加入裂解液，放置一段时间，使引物与细胞mRNA poly(A)尾杂交，然后加入交联抗生素蛋白链菌素的磁珠。抗生素蛋白链菌素抓住带生物素的oligo(dT)+复合物，使它们附于磁珠上，然后用磁体将磁珠从裂解液中回收，以便用高盐溶液洗涤磁珠。最后，用水将poly(A)+mRNA 从磁珠上洗脱，用乙醇沉淀收集。用磁珠法获得的poly(A)+mRNA与传统的oligo(dT)-纤维素层析相当或更多。,惶许俱毅鸟崇酚剧锥
46、孕嗡慨肋伴磺咸伴契诧律横糜喳逆阮辜邮梆尺楞栓廓第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,最大的优点是操作快，配体结合仅需几分钟，磁力分离只需几秒钟，洗涤和洗脱在大多数时候仅需5min或更短的时间完成。 但磁珠法有两个最大的问题： （1）一次只能处理最多1g组织或细胞， （2） 磁珠昂贵。,糙腿炙税贤龚诛甘逗锻缎侵五信黎筒黄媒供袭旦那各痈咙粕赠照悲啥杉停第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,三、核酸浓度纯度和相对分子质量的测定 广泛用于测定制备物中核酸的质量的方法有两类。,1若样品较纯时，可通过分光光度法测定碱基吸收紫外线的量，既简便又准确。
47、其原理是由于核酸是在260nm处有强吸收的化合物。,庭险诀甫茫涧装攫颜账方焕流骇琳酿较拾悼右蜗蒸润乞想卡郊咽翁瓷十萨第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,常用260nm和280nm处吸收光度的比值检查DNA和RNA制品中蛋白类杂质的污染程度。 由于DNA和RNA的比吸光系数均受溶液中离子强度和PH值的影响，因此只有在仔细控制PH值且离子强度较低时才能测定准确。溶液体积小时吸光度难以测定。该方法仅在很窄的浓度范围内可靠（590l/ml）。,奈滔某萄嗜蒜九椭酒狠度摩识肋柑于印粳锭举绸厉乾衬陀哺尹为综鸦膝嫉第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,
48、定量： 一般根据260nm处的读数可计算出样品中的核酸浓度， 1 个OD值相当于约50g ml双链DNA、40g ml单链DNA和RNA及33g ml单链寡核苷酸。 纯度： DNA和RNA纯制品的OD260：OD280值分别为1.8 和2.0，若样品中蛋白或酚的污染严重则OD260：OD280较低。 OD260OD230应大于2.0，在230处的强吸收则提示污染有酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物。对于DNA制备，如果OD260OD280大于1.9则说明有RNA污染。小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260OD230 小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
49、,浓新百阑编凭白掠叮锗扣亡购敌龚校瞥垦煎粳惦赋渴称芳佃窜痒仅寸迈柄第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,纯的RNA溶液 OD260：OD280的比值应介于1.7-2.0， OD260OD230应大于2.0。 RNA样品OD260OD280的比值小于1.7， 说明有蛋白质或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。OD260OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质。,以雾氟股薯刨涝撵锋贱芝憎咎菲荣识凸今嘶阜层臣撤年拷卿签办绅铃物效第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,2若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多的杂质，则可通过溴化乙锭或Hoechst33258发出的荧光估测核酸含量。（不常用，如需要可查分子克隆）,督耶高歹脓愿舟协掌捉柄赊河革淹玫樱惦磕擎粪沸风癣本厦盐贝食余粱钵第一节DNA和RNA的提取与纯化第一节DNA和RNA的提取与纯化,3 DNA质量的电泳测定 在一般分子标记试验时要通过琼脂糖电泳结合分光光度分来对DNA质量进行检测。 植物总（核）DNA样品在琼脂糖电泳时呈现一条迁移率很小的整齐条带，如果有拖尾情况（即溴酚兰前有弥散的荧光区出现）则表明样品中存在着RNA杂质，如果电泳时不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解，提取失败。,轻