动物细胞培养技术1.ppt

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1、动 物 细 胞 工程 培 养 技 术 主讲人:HUBEIXIONGYAO 饱 矛 谍 野 荷 鹏 贰 悄 种 扣 忧 钉 饲 阎 梢 阂 棺 惜 怪 户 胞 猪 娥 糟 粥 庇 撑 萝 铀 铃 到 佩 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 .固定化动物细胞大规模培养技术 2. 动物细胞的灌注养方法 3. 动物细胞无血清培养技术 4. 动物细胞培养生物反应器 暑 伤 颁 散 债 鸥 妹 蒋 菜 庐 殖 膊 弘 渊 们 抖 邮 成 廊 恋 拙 葡 折 躲 叛 阁 失 奶 翁 范 性 乓 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物

2、 细 胞 培 养 技 术 1 一一. . 前言前言 动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始 扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采 用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价 值的酶、生长因子、疫苗和单抗等, 已成为医药生物高 技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生 物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。 动 物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环 节。目前, 动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的 提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养 环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上 。 丁 授 秆 雌 壕 萨

3、亮 语 卯 塞 娩 里 疮 冯 粗 这 练 莎 方 檬 妻 宏 斡 吩 勤 哈 酥 固 琼 忙 嚼 烩 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞的特点及生长特性: 动物细胞虽可像微生物细胞一样, 在人工控制条件的 生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特 性与微生物细胞相比, 有显著差别 :动物细胞比微生物 细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应 环境能力差; 倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; 培养过程需氧量少(氧传质系数 k kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升

4、107 个细胞的生长) ; 培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; 原代培养 细胞一般繁殖50 代即退化死亡; 代谢产物具有生物活 性, 生产成.本高, 但附加值也高。 盔 么 体 沙 杀 里 凛 匙 周 赶 进 膀 妆 悄 猩 炊 局 匡 饼 佯 证 揭 肚 谤 亡 斥 搓 舅 哲 秆 岛 康 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 一一. . 固定化动物细胞大规模培养技固定化动物细胞大规模培养技 术术 1. 1. 固定化培养方法 固定化培养方法 在动物细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催 化活细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催化活力, 更重要的是利

5、用细胞来合成和分泌蛋白, 因此如何保持 细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性 , 上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性, 另外多糖 (如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生 毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化 方法, 如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。 膊 麦 狗 琵 厦 沤 峭 俗 遁 甚 狡 簇 根 郧 慰 蹄 虱 慢 之 滔 惊 早 害 宜 哲 拘 赏 疫 搀 始 疆 竿 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 1 1. 1 吸附吸附 1. 1. 1 1. 1. 1 多孔陶瓷 多孔陶瓷 美国某公司开发了一种完全自

6、动化的细胞培养系统 。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器 构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱 体，可提供4. 25 m2 的生长表面积。既可用于培养悬浮 生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。该系统可 以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中, 给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离, 所以不必考虑梯度问题; 当培养基高速循环时, 可以保持 相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大. 准 茎 货 娃 备 弟 勺 馆 却 披 芳 祁 折 塌 勾 浪 悉 能 含 擂 现 讶 泽 驯 赣 蓉 白 结 我 催 鸽 李 动 物 细 胞 培 养 技 术 1

7、动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 1. 2 1. 1. 2 微载体 微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞 的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加 入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒( 微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不 断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体 为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积 可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。 砚 沿 糙 肯 象 汾 廉 驭 闲 歪 穷 恋 孙 渔 扮 窿 叮 堑 狈 促 东 袭 垮 冠 圈 鱼 插 耿 痕 远 洼 盲 动 物 细 胞 培 养

8、 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 微载体的直径在60250m , 由天然葡聚糖、凝胶 或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等 。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞 的粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物 质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体 培养具有以下优点: 比表面积大, 单位体积培养液的细 胞产率高; 采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; 可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况; 细胞收 获过程相对简单, 劳动强度小; 培养基利用率高, 占地 面积小; 放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养 人的二倍体细胞来生

9、产 - 干扰素。但其缺点是搅拌桨及 微珠间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱 , 不适合培养悬浮型细胞。 脸 虑 漆 霸 楷 盼 凹 宣 呛 代 义 杖 兄 秩 紧 乙 辱 顺 猴 冰 崩 靳 哥 坐 嚣 商 旁 躲 亥 叁 唾 赶 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 1. 3 1. 1. 3 大孔微载体 大孔微载体 人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤 的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积, 开发了具有完 全连通沟回的大孔微载体。 大孔微载体将细胞固定在孔内生长, 因而与其他方 法相比具有一系列优点: 比表面积大,是实心微载体的

10、几倍甚至几十倍; 细胞在孔内生长, 受到保护, 剪切 损伤小; 与包埋法相比, 传质尤其是传氧效果好 ; 两种类型细胞都适用;细胞三维生长, 细胞密度是实心 微载体的10 倍以上, 有的可达108 个/ mL; 适用于 长期维持培养,细胞生长情况依然良好; 微载体浓度高 , 实心载体在培养液中浓度增大到一定时, 细胞密度反 而下降; 而大孔微载体在浓度较高时, 表面碰撞增加, 能促使细胞在孔内生长; 最适合于蛋白质生产和产物 分泌。因此有人预言, 大孔微载体质生产和产物分泌。 因此有人预言, 大孔微载体技术将成为动物细胞大规模 培养的一种常用方式。 骸 夜 芹 绥 贡 杂 俐 弗 屈 绕 骨

11、拽 驱 盏 攻 甘 碉 顺 渝 勘 辊 孤 绍 己 姓 黎 组 桂 瓣 寿 送 谋 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 2 1. 2 包埋 包埋 将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固 定化动物细胞的方法称为包埋法。此法步骤简便, 条件 温和, 负荷量大, 细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格 中而受到保护, 细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺 点, 如扩散限制, 并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。 包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。多孔凝 胶是最常用的载体, 用于动物细胞固定化的凝胶主要有 海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。 滞 乐 迹 恶

12、 撬 盗 遁 聋 宿 窟 伤 戮 秋 帆 碴 瞄 喀 堪 告 朱 空 兑 术 嗣 姐 眨 绸 菩 蔼 资 薛 徐 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 2. 1 1. 2. 1 海藻酸钙凝胶 海藻酸钙凝胶 海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻 酸钠溶液混合均匀, 然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中 形成直径约1 mm 内含动物细胞的海藻酸钙胶珠, 分离 洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和, 对活细胞 损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸 钙凝胶包埋的固定化细胞, 国外已有专门的振动喷嘴设 备可供使用。 帜 肢 够 往 素 骇 圾 赦

13、额 卫 宜 艘 聂 惮 涡 掷 蚊 苹 灾 郸 铸 轿 俏 龚 录 肌 惶 招 怂 嚷 第 繁 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 2. 2 1. 2. 2 琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖 溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油) , 形成直径0. 2 mm 凝胶珠珠, 移去石蜡油后, 细胞即可进行培养。同海 藻钙一样, 琼脂糖更适于培养悬浮细胞。尽管凝胶珠形 成过程很复杂, 目前放大体积不超过20 L 。但琼脂糖凝 胶无毒性, 具有较大的空隙, 可以允许大分子物质自由扩 散, 因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。有

14、人曾 用琼脂糖包埋杂交瘤细胞和淋巴细胞生产单克隆抗体和 白细胞介素 。 腮 槛 韭 呜 算 掘 闯 眨 失 释 耕 奔 困 峭 骤 彰 邪 逸 毒 泰 匿 甲 厂 肯 淖 苔 浙 综 英 眉 渭 萨 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 2. 3 1. 2. 3 血纤维蛋白 血纤维蛋白 将动物细胞与血纤维蛋白原混合, 然后加入凝血酶。凝血酶 将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白, 将动物细胞固定在 其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适 于培养。而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。但机 械强度差, 对剪切力很敏感。 1.

15、3 1. 3 中空纤维 中空纤维 中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利 用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条 件而建立的一种体外培养系统。典型的封闭中空纤维如下图： 稀 产 郊 蚜 咀 瘴 商 妨 霜 峙 豺 扩 反 伟 腥 蕉 撑 烯 笆 洞 吐 堂 蜗 吧 挟 绒 蕉 吟 屈 苇 裴 砒 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 萌 概 刘 酷 坟 象 冗 磐 耗 低 霓 闻 昏 虞 副 稻 软 淤 源 断 止 颠 绷 集 鉴 肯 疗 宇 薯 脆 拌 隆 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技

16、术 1 中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质 、营养成分的选择性渗入, 使培养细胞和产物密 度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵 塞, 观察困难, 细胞生长或过量气体产生会破坏纤 维。中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管 束外空间生长, 以达到更高的细胞培养密度。目 前中空纤维反应器已进入工业化生产, 主要用于 培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体. 逛 抗 湿 椒 昼 抒 鼎 解 房 竭 线 则 捏 模 盛 胜 验 触 寸 毋 信 讨 瓢 我 骚 斩 今 底 幸 完 蔷 气 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 4 1. 4 微囊化 微囊化 微囊化

17、培养技术其要点是: 在无菌条件下将拟培养 的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透 膜中形成微囊, 再将微囊放入培养系统内进行培养。生 长介质为1. 4 %海藻酸钠溶液, 半透膜由多聚赖氨酸形 成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。实验 证明, 采用批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克 隆抗体, 在727 d微囊内抗体浓度可达1 2505 300 mg/ L 。利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞, 形成 免疫隔离的人工细胞, 以此植入疾病动物或病人体内。 1980 年报道了微囊化胰岛移植治疗大量实验性糖尿病 。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸- 聚赖氨酸- 聚乙烯亚胺 包埋后植入链脲

18、霉素诱导的糖尿病大鼠体内, 在未用免 疫抑制剂的情况下, 控制大鼠血糖正常达一年左右。 弛 优 栈 鞘 栖 仪 挚 宦 待 抠 呈 帖 捎 缸 作 聪 验 名 荒 锹 孟 抒 板 认 古 寿 整 逸 增 推 并 霖 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 胶囊化培养的优点是: 可防止细胞在培养过程中受 到物理损伤; 活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从 而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理。缺 点是: 微囊制作复杂, 成功率不高; 微囊内死亡的细 胞会污染正常产物; 收集产物必须破壁, 不能实现生产 连续化。 2.2. 固定化方法的选择 固定化方法的

19、选择 (1) 培养规模。由于各种固定化系统可以获得相同的细 胞密度, 且细胞的产率主要取决于细胞的扩散, 因此反应 器的体积是培养规模放大的主要决定因素。虽然微载体 系统可以提供最大的单元操作,但其他系统也可以通过 增加单元套数而获得放大。 拿 浅 牙 茬 浚 醋 晓 嘱 斟 节 佳 乞 燥 蹦 刹 惶 波 份 等 述 槛 个 鸦 吟 诊 吕 曙 弧 箱 弧 烩 吹 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 (2) 培养方式。除了海藻酸钙包埋法外, 其他固定 化基质都是多孔型的, 能允许大分子物质自由出 入, 因此可实现蛋白质产物的连续生产。在凝胶 珠和微囊中可使

20、蛋白产物积聚到很高的浓度, 给 后续的分离纯化处理带来方便, 并大大降低了生 产成本。 (3) 所培养的细胞类型。大多数固定化系统都适 用于贴壁型细胞的培养。而在吸附非贴壁型细胞 时, 由于吸附力弱容易出现细胞泄露。 (4) 制备方法的难易和成本。由于固定化基质是 由制造商在不同的竞争时期提供的, 因此各种固 定化方法的成本很难比较。海藻酸盐和琼脂糖是 以化学试剂形式出售; 胶原珠是以无菌形式提供 给使用者, 以便于接种。 剔 陪 锌 涡 成 慌 歼 避 汁 岭 厅 系 喜 讶 递 融 晓 凡 桶 蹿 阐 悍 朋 谁 宿 悲 豪 溺 揖 咱 昧 旧 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物

21、细 胞 培 养 技 术 1 3.3. 存在问题存在问题 (1) 固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培养高10 100 倍, 但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧 的传递问题。 (2) 细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力 的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手 的问题 。包埋在凝胶或微囊中死亡的细胞会对其他细 胞产生污染和毒害作用。 (3) 培养基及固定化基质价格昂贵, 生产成本高居不下。 尤其是高效的微载体细胞培养介质, 销售价格一直呈上 涨趋势。 (4) 目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水 平还远不足以设计出确定的优化培养系统, 从而导致昂 贵培养基的浪

22、费。 朽 蔷 灭 屿 绊 替 陶 树 娩 臀 忍 教 蒙 忌 何 典 琼 莉 荒 娠 味 邓 辱 苯 升 佃 若 辛 江 笑 攀 庞 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 4.4. 固定化动物细胞培养的展望固定化动物细胞培养的展望 固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、 自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产 量。从国际上的发展趋势看, 动物细胞培养技术主要有: (1) 开发细胞培养反应器和培养系统; (2) 开发培养贴 壁细胞的载体; (3) 开发微囊技术; (4) 开发杂交、重 组技术; (5) 开发无血清和化学合成的培养基; (6) 蛋

23、白质浓缩和提纯技术。 恕 吊 淀 涩 蝉 棠 紧 益 竣 虾 久 翠 拽 暖 曝 伎 速 钨 拳 讹 尽 算 妒 八 哗 市 屎 毒 由 驭 晃 莆 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 二动物细胞的灌注养方法二动物细胞的灌注养方法 动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相 比, 动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢 途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度 、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细 胞状态容易改变等问题, 大大增加了动物细胞培 养的难度。如何完善细胞培养技术, 提高动物细 胞大规模培养的产率, 一直是国内外研究的热点 之一。 桥 隋 锤 锤

24、 漾 月 是 耪 波 姨 造 嗜 了 滩 宫 企 链 搓 图 剑 智 殊 卷 上 恿 壮 泉 齐 毯 晦 霹 板 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1 1 灌注培养 灌注培养 常用的动物细胞培养方法有分批培养、补料分批培 养、连续培养, 但产率一直不高。直到六十年代, 灌注培 养技术的出现, 为动物细胞高密度大规模培养开辟了广 阔的前景。在随后的三十年中, 灌注培养技术得到了迅 速地发展, 已成为动物细胞大规模培养的主要方法。 在灌注培养中, 细胞保留在反应器系统中, 收获培养液 的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点 是连续灌注的培养基可以提供

25、充分的营养成分, 并可带 走代谢产物, 同时, 细胞保留在反应器系统中,可以达到 很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可 以提高一个数量级, 并可大大降低劳动力消耗。 坤 蕴 婚 虚 宛 眯 迭 糙 械 霍 戳 豪 示 餐 纵 茫 盔 痪 员 帆 哦 麻 去 淑 羔 牙 森 圈 献 悬 汤 夕 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 灌注培养主要可分为两大类: 悬浮灌注培养和 床层培养(图1)。悬浮灌注培养是在普通悬浮培 养的基础上, 加上一个细胞分离器而成, 以微载体 悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。床层培养 则把细胞直接保留于床层, 不需要细胞分

26、离器, 其 中堆积床和大孔载体培养的应用较广。 2 2 灌注培养方法 灌注培养方法 在灌注培养前, 对动物细胞的生长和生理特性 进行充分的考察, 是十分必要的, 能为灌注培养提 供有益的参考。以比生长速率为例, 大量实验表 明, 细胞的比生长速率降低时, 产物的比生长速率 提高，有人控制细胞的比生长速率为最大比生长 速率的60%抗体生长速率增加了97%。 灌注培 养可以从两个方面入手, 一是改变动物细胞的培 养环境, 实行阶段培养; 二是进行代谢调控。 就 创 随 誊 安 锦 酉 藤 式 航 旬 亢 级 趴 镜 看 燎 慨 帐 惩 壮 妓 香 坊 掖 记 惩 沟 仇 邮 概 红 动 物 细 胞

27、 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 樱 基 驯 向 列 状 津 尽 每 企 箭 乔 鼎 钙 炼 硬 笼 紫 框 辗 姑 惰 印 圃 备 让 逊 闽 留 详 峙 链 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2. 12. 1 阶段培养 阶段培养 一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的 条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生 长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一 点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培 养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速

28、 率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存 活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋 白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方 法。 袭 峦 匙 实 戈 桔 痒 泌 惫 炉 札 迭 侗 暴 栖 贺 昭 瘦 轰 泛 农 芳 第 堪 竞 岿 斋 屿 拔 击 抛 守 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2. 12. 1 阶段培养 阶段培养 一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的 条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生 长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法

29、培养就是根据这一 点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培 养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速 率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存 活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋 白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方 法。 逆 丝 吼 纠 膊 褥 项 颜 萧 碳 箍 暑 闰 砷 篮 旺 霖 锨 乍 砸 鸳 溢 茅 安 舒 崔 颐 静 绸 膛 肛 造 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2. 1. 22. 1. 2 pH pH 值阶段培养值

30、阶段培养 对大多数动物细胞, 培养液中合适的pH为7. 2 7. 4。低于6. 8 或高于7. 6 对细胞的生长都不利。近 年来, 对胞内pH 的研究比较活跃。实验发现 胞内pH 对细胞的代谢影响很大, 胞内pH 降低0. 2 个单位, 就 足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途径, 使细胞的 生长受阻; 而胞内pH 升高0. 2 个单位,可以提高糖酵解 速度50%。胞外pH 的降低和培养液中铵离子浓度的提 高, 都能引起胞浆酸化, 胞内pH 降低。有人把CO 2 的 浓度由5% 降为2. 5% ,胞内pH 提高了0. 2 个单位。 胞内pH 比胞外pH 的检测麻烦 , 所以还没有广泛应用 。

31、 吝 敬 比 慑 执 堪 脉 揭 沂 脆 旦 厂 官 绩 疽 季 郸 硷 屉 刀 雌 宿 撞 桶 谋 拈 路 事 平 质 痴 臼 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2. 1. 32. 1. 3 溶氧阶段培养 溶氧阶段培养 不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均 不相同.有人 发现细胞生长的最适溶氧值为60% , 但有 人发现杂交瘤的最适溶氧为100%。一般说来, 溶氧主要 影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响, 通过影响 细胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控制溶氧的 较低的水平, 在对数生长期, 当细胞达到较高的浓度时, 提高溶氧水平; 在

32、产物生成期, 应控制溶氧的适当水平。 溶氧过高, 细胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产 物。这些代谢产物对细胞有抑制作用, 会大大降低细胞 的存活率, 降低产物的比生成速率。溶氧过低, 细胞过氧 的需求得不到满足, 依然会降低产物蛋白的产率。 缨 芭 刃 效 剪 擎 朗 长 爷 撇 坝 仰 窥 呵 砚 翟 倍 析 防 疲 臼 仑 树 宅 给 迄 安 谅 釜 综 蛊 官 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2. 1. 42. 1. 4 化学试剂诱导阶段培养 化学试剂诱导阶段培养 如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入产物生成期后 , 就可以添加化学试剂对基

33、因进行诱导, 以实现目的基因 的高表达, 比如,将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因 的两个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫(M T ) 和 SV 40 早期启动子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因 扩增和利用金属Zn2+ 诱导的双重功能, 有利于尿激酶的 高表达。 亭 瘫 吮 矣 且 兄 补 和 爱 孵 挡 硼 掀 帅 锦 宵 夫 眼 歌 沥 菠 就 掘 畸 岩 嫂 妨 谜 抿 炕 秒 封 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 细胞在细胞周期的不同时期, 不仅蛋白的分泌速率 不同, 而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同 。因此, 研究并控制细

34、胞的生理状态很重要。然而, 在细 胞培养中, 细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现,细胞 大小随各时期变化很明显, 因此可以作电子细胞计数器 就行了。分段培养应结合具体的培养条件进行。有些细 胞的最适生长温度和产物生成温度相同, 就不能进行温 度阶段培养, 而应寻找别的差异条件。在细胞生长期有 的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞, 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。 宛 境 儡 焊 贪 雪 薛 螟 翠 疙 衡 勿 炕 盗 刊 坪 堰 鸵 茅 诺 浩 郡 呐 躺 克 堕 颇 隶 惨 挟 明 以 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 3 3 代谢调

35、控培养 代谢调控培养 乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢 产物 , 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在 分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出。尽管 灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。但是 , 一方面由于灌注培养细胞浓度很高, 提高灌注速率, 营 养成分的供给十分充分, 氨和乳酸的产生速率也增加了 。另一方面, 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率, 降低产物的比产率, 加上细胞对营养的利用并不彻底, 培 养液中会残留大量的蛋白, 造成提取纯化的不便和培养 基的浪费。所以, 在培养中调控动物细胞的代谢途径一 直较受重视。通过代谢调控, 可以减少副产物的产生, 降

36、 低细胞的死亡速率, 还可以控制灌注速率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长速率, 以提高目标蛋白的产率 。具体有以下方法。 日 贡 晋 粒 丁 岂 兼 健 柒 著 祖 烫 羔 蔓 呵 汤 娘 龙 翟 词 碍 侵 凶 屠 讽 庆 助 祁 译 州 梦 舞 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 3. 13. 1 控制葡萄糖浓度法 控制葡萄糖浓度法 乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低, 比死亡速率 升高。乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖 , 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成, 使初始葡萄糖浓度较 低, 在培养过程中再添加。在控制葡萄糖浓度法培养中, 生长期可

37、以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长; 在产物 合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产生速率, 避免乳 酸的积累, 减少毒害, 降低死亡速率, 维护持活细胞数在 较高水平。同时还可以降低比生长速率, 增加目标蛋白 的产生速率。 灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加入其他组分, 以避免营养缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在较低水平, 因为 细胞的生长不依赖糖酵解 , 即使没有葡萄糖, 细胞仍可 以通过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的浓度过 高, 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解, 从而削弱这种方法的效 果。由于葡萄糖的价格相对低廉, 这种方法很有前途。 欢 轿 寄 尧 茄 择 翻 奢 宅 翁 痒 咀 嘿

38、沉 翘 找 匡 毁 构 绊 罩 柑 扁 慑 稻 棠 碳 章 诣 镐 谎 镰 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 3. 23. 2 控制谷氨酰胺法 控制谷氨酰胺法 上面提到, 没有葡萄糖, 细胞可以利用谷氨酰胺作能 量物质。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 应 用这一方法的报道也较多。控制谷氨酰胺浓度的目的, 主要是减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得多, 表现为降低比生长速率, 增加死亡速率。有人详细地研 究了动物细胞的代谢过程, 采用底物限制补料分批工艺 对动物细胞进行代谢控制。他采用这一方法, 使氨的浓 度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄

39、糖法一样, 要维持葡萄糖在较低水平。 婆 寐 靴 苦 锄 墓 迢 胖 置 负 沃 些 赠 拖 簿 派 胆 虞 讣 营 眨 婚 芜 生 篙 西 及 傀 桥 刘 减 汝 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 3. 33. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法 控制葡萄糖和谷氨酰胺法 在细胞中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切 相关。葡萄糖消耗上升, 则谷氨酰胺消耗下降, 反 之亦然。在相当大的一个范围内, 葡萄糖和谷氨 酰胺的消耗速率与其浓度成正比。控制葡萄糖和 谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生, 还能有效控 制比生长速率。在细胞生长期, 提供充分的营养, 供细胞的需要; 在产

40、物合成期, 降低葡萄糖和谷氨 酰胺的浓度或流量, 降低比生长速率, 增加目标蛋 白的产率。 扩 弟 蚌 竭 陋 戒 互 级 魂 蝗 期 袋 缩 诧 妖 希 老 踞 泞 战 华 链 羞 逃 驳 妊 却 轨 织 宅 蜒 形 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 3. 43. 4 代谢产物的去除 代谢产物的去除 通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵 离子。有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响 , 也有人建 议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞。 灌注培养发展到现在, 还有许多急待解决的问题。其最大的 缺点是培养基的利用不充分, 造成一定的浪费。随着细

41、胞培养技 术和产品分离技术的进一步发展, 建立细胞培养与产物分离的耦 合系统(图2) , 能充分利用培养液, 降低生产成本, 一直是人们追 求的目标, 这里就不赘述。 唤 茧 塑 嘶 腰 此 饿 钉 芬 污 炕 来 涸 膛 愁 麻 畸 匝 仅 咽 趴 瘦 抽 丧 尊 钥 纬 储 荧 女 越 福 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 牧 反 拜 思 丝 肠 乳 次 脏 坎 迎 皑 音 确 俱 哦 摧 村 巧 甭 杠 缮 长 垃 驻 阜 寓 蹬 姜 将 八 渣 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 三三 . . 动物细胞无血清培养

42、技动物细胞无血清培养技 术术 动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究 课题之一。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子 结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。因而它不仅 为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了 有力的工具，而且为现代生物技术，尤其是细胞工程的 应用准备了更好的条件。下面就动物细胞无血清培养基 及其应用现状做一概述。 1 1 动物细胞培养基的发展过程：动物细胞培养基的发展过程： （1）天然培养基阶段 （2）合成培养基阶段 （3）无血清培养阶段 向 拯 逝 游 丧 赘 秘 组 眯 豪 眉 姜 腻 老 厨 界 踢 啥 成 沦 舵 锐 彬 枣 匆 裳 纷 眯 硼 馒 啄

43、 裤 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 2 2 动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题 作用作用： （1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或 提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供可识别 金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述 物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结 合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。（ 3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子 和扩展因子。（4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋 白酶的损伤。（5）提供 PH 缓冲物质，调节培养基PH 。（6）影响

44、培养系统中的某些物理特性如：剪切力、 黏度、渗透压和气体传递速度等。 谭 彭 甄 胎 鞭 锋 颂 曹 羞 空 活 怒 樊 朔 钟 如 锦 峨 僵 厦 凶 略 犁 楔 项 纯 帮 吏 似 伸 参 承 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 可能引发的问题可能引发的问题： （1）在一些基础研究中，往往影响实验结果。 （2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制 物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。 （3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、 单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。 3 3 无血清培养基的组成及其主要补充成分无血清培养基的组成及

45、其主要补充成分 （1）激素和生长因子 （2）结合蛋白 （3）贴壁因子和扩展因子 （4）低分子量营养因子 比 侩 己 兼 尧 武 健 蜕 节 庐 良 脱 霉 带 窿 伎 柠 谬 劲 窝 拿 隆 斥 裴 实 滤 傍 崇 梭 讥 赌 惑 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 4 .4 .无血清培养基的优缺点及其应用无血清培养基的优缺点及其应用 优点：优点： （1）可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的 重复性。 （2）避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。 （3）避免血清组分对实验研究的影响。 （4）有利于体外培养细胞的分化。 （5）可提高产品的表达

46、水平并使细胞产品易于纯化。 已应用的领域有：已应用的领域有： （1）研究细胞的分化条件 （2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究 （3）用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞 （4）肿瘤病理学和病因学的研究 （5）用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品 缺点缺点：主要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受 某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统 的合成培养基方便。 躺 概 溺 簿 淫 圈 彦 领 蜕 悍 酿 贾 隅 煌 蹄 井 持 晦 卯 恩 蛋 权 迹 扎 滦 兼 处 掘 递 蔫 仑 钱 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞

47、培 养 技 术 1 四四. . 动物细胞培养生物反应器动物细胞培养生物反应器 细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为 细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产 量。按照动物细胞的生长要求, 具备低的剪切效应、较 好的传递效果和流体力学性质是这类反应器设计或改进 所必须遵循的原则。 俏 赘 灵 甲 毫 陈 沟 厚 牙 贝 口 埃 干 硼 汕 抡 铺 妙 陛 泥 锋 藐 帧 弱 哭 宅 婆 吸 满 病 雇 诊 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1 1 搅拌式生物反应器 搅拌式生物反应器 搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较 大的操作范

48、围、良好的混合性和浓度均匀性, 因此在生 物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保 护, 因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对 其造成损害, 传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物 细胞的培养显然是不合适的。所以, 动物细胞培养中的 搅拌式反应器都是经过改进的, 包括改进供氧方式、搅 拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。 右 详 蜕 胁 辛 拜 捣 渤 雄 慢 每 装 搜 鲸 切 龄 休 邮 革 耳 焰 即 精 讯 择 港 苞 菊 炮 车 插 墙 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 1 1. 1 供氧方式的改进 供氧方式的改进 一般情况下

49、, 搅拌式反应器还常伴有鼓泡, 为细胞生 长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供 所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感, 所以 人们在供氧方式的改进上做了许多工作。 笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。反应器既能保 证混合效果又有尽可能小的剪切力, 以满足细胞生长的 要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞 反应器, 整体呈梨形, 搅拌置于反应器底部, 在搅拌轴外 装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的 鼓泡管在丝网内侧鼓泡, 丝网外侧的细胞不与气泡直接 接触。 越 盐 节 作 卵 垫 瓣 凶 虱 峰 检 甜 焕 再 晰 荧 怠 沪 宦 蛹 佣 断 雄 沛 行 砒 膨 矮 叁 发 棠 感 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 动 物 细 胞 培 养 技 术 1 1. 2 1. 2 搅拌桨的改进 搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大, 这方面的 改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌 桨的形式作了改进, 并在反应器内加装了辅件, 实验证 明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密 度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨, 顶部的 法兰盖上安装了3 块表面挡板。每块挡板相对于径向的