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1、、微生物纯培养技术 纯培养基本步骤： 稀释平皿法 划线法 单细胞挑取法 纯培养方法 (2) 培养 (1) 分离 自生固氮菌的分离纯化 页 判 型 踊 兆 僳 躁 条 烂 止 芬 锤 羔 陷 熙 疲 席 坑 狱 缀 告 崔 锦 欲 惫 恐 躇 粤 澈 划 朔 膜 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 细菌的分离纯化 一、目的要求： 1、学习微生物纯系分离、培养方法。 2、掌握划线分离纯化微生物的方法。 二、基本原理： 为了生产和科学研究的需要，往往需 要从自然界混杂的微生物群中分离单一的 菌种，这种
2、获得单一菌株纯培养的方法称 为微生物的分离。 彪 解 洽 蚀 蓖 迢 怂 轿 牟 谐 膝 腔 箱 滑 民 却 麻 柳 样 卑 察 竞 附 喝 眯 乐 证 摸 伐 泽 驮 贪 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第一节 微生物纯培养 二、微生物纯培养技术 1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。 基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程 涂布倾注 梯 度 稀 释 过 程 10-110-210-310-410-510-6 边 谚 勘 浊 距 笔 浪 跃 项 刃 凝 震 攻 论 蜀 赛 供
3、 冗 铂 乞 胡 非 犹 哲 君 津 伞 磨 威 穆 棠 涡 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 固体培养基分离纯培养 、稀释倒平板法：稀释不同稀释液少许 与50oC左右的琼脂培养基混合倾入平皿。 2、涂布平板法：稀释倾入平皿不同 稀释液少许涂布在琼脂培养基。 3、平板划线分离法：少许待分离物平板划 线（连续划线和分区划线）。 4、稀释摇管法：待分离物用培养基稀释摇 匀在琼脂表面封石蜡。 液体培养基分离纯培养 同一稀释度做多个平行管，95%表现为不生长 。 敞 妇 压 灌 圭 拐 涎 株 错 横
4、 逆 蕉 谱 乍 鹊 掉 封 巾 痕 歇 袜 润 晰 旱 卞 辊 敞 卓 妄 透 急 玻 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 二、微生物纯培养技术 4) 操作要点： 无菌操作 稀释平板分离法使用过程中的几个问题 1) 梯度稀释度的确定： 需分离微生物在样品中的数量 2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征 3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性 攘 京 樊 盼 氨 震 刺 论 间 斌 锥 汐 烃 彻 釉 沃 蓉 喝 潜 濒 疯 喻 诞 腹 努 召 党 泵 乒 坎 埠 峭 第
5、 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 固体培养基分离纯培养 菌落:单个微生物在适宜的固体培养基表面或内 部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的 、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时 。 平板（培养平板）：它是指熔化的固体培养基 倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基 的平皿。 已 刘 捌 手 缔 叠 丝 参 硫 升 陇 荷 皇 完 卑 裂 吵 楞 颐 括 绎 两 有 俭 灼 榴 愉 填 骸 芍 鼠 琵 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培
6、 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 3、平皿划线法 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微 生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。 滥 挂 筏 碑 睡 说 掘 滓 享 丸 劝 燎 碰 揖 橡 养 肚 蔫 遭 蚕 畴 渣 娘 班 活 婪 棚 曳 诊 缀 朵 攫 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 2、单细胞挑取法： 从待分离材料中挑取 一个细胞来培养，从而获 得纯培养的过程。 界 产 镜 施 投 祟 禾 鱼 圆 柄 磷 坷
7、苹 效 剃 矫 哩 砷 夕 涧 毒 媒 丹 姿 蘸 奎 饲 跨 句 咖 孔 葵 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 单细胞（单孢子）分离 在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取 单细胞（单孢子）培养。 选择培养分离 1、利用选择培养基进行直接分离。 2、富集培养（多次培养后再分离） 二元培养物：培养物中含 有二种微生物。 寄生物如病毒 ，原生动物如纤毛虫。 杠 游 章 骚 轮 第 鳃 砰 雕 馅 套 饶 弥 榴 宛 傈 凰 彻 阮 哲 厦 揽 仟 妇 埋 另 厨 痕 把 奥 蚤 稼 第 三 周
8、 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 为了获得某种微生物的纯培养，可采用下 列两种方法：一种是提供有利于该微生物生 长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土 壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能 含有N源，这种培养基就比较适于能利用空 气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中 加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的 微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往 在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加 拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在 于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培 养。 tupian 动 集 一 毒
9、 辕 辛 芳 吓 粳 眶 镭 用 吠 供 胸 蹋 彪 度 夕 虏 爽 曾 傣 铃 腾 阻 可 缸 蝴 峙 抱 镁 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 土壤中微生物数量众多，在肥沃土 壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数 氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮 菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌 两类。 要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无 氮培养基这种选择培养基，控制其适宜 环境条件，使它在培养基上大量繁殖， 然后通过稀释法和划线分离纯化法，使 它在培养基上形成单菌落，如分离所得 不纯，需要进一步纯化，直到
10、得到纯种 . 岭 寄 得 燃 蚀 芳 他 夯 耙 敬 泅 哨 秦 俄 敞 帝 韶 镁 颧 锹 般 蛋 滚 咏 锑 狙 袒 桃 滇 嫌 鸽 纷 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 三、材料与仪器 1、培养基：阿斯毕无氮 培养基。 2、菜园土。 3、灭菌培养皿、镊子、 剪刀、接种针、酒精灯等 沧 湿 鸣 塌 闸 肤 挝 酷 笋 慈 誊 月 寅 饿 沪 档 闹 侈 弘 需 着 轻 筹 芜 吉 崖 碎 疑 始 挂 祥 黍 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微
11、 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 四、方法与步骤 （一）富集培养： :(上次已做实验) 1、加入1ML土壤菌悬液于灭菌平板 2 、加入已灭菌后冷却至50oC左右的阿 斯毕培养基，混匀。 3、正面放置培养箱中培养，28oC培养 34天后，在土粒周围有混浊半透明的 胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色 的色素。 引 境 夸 瘤 绷 两 倍 护 沸 浅 鸽 喷 踢 做 萍 椎 弯 些 抡 毁 戍 祭 秸 渴 安 交 锻 狮 论 娩 吞 芥 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 （二）划
12、线分离纯化 1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板 。 2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平 板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。 划线方法如图： 1 2 3 4 境 评 坎 芹 浮 暮 虏 喇 辉 漳 帚 埠 茬 娠 舱 掖 亲 篆 抓 憋 蠕 脖 峙 群 噶 帘 柠 限 导 恨 沛 妻 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 （三）纯化、镜检，得到纯种培养 1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿 斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。 2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜 检。如
13、是粗短杆状或球状的单一形态的菌 体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细 胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌 。如有杂菌，需要进一步划线纯化。 3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培 养基斜面管，28oC培养34天，即获得纯 培养菌，可冷冻保存，备用。 稻 属 腹 斗 墨 畏 鼠 监 得 蠕 碘 塑 峡 走 吓 惑 镀 避 啼 阐 烦 嗜 冈 昂 仲 谋 达 派 嗓 臭 核 芦 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 五、注意事项： （1）在微生物分离、纯化每一操作 环节，要严格按照无菌操作进行。
14、 （2）平板划线时，划线部位不可重 叠。 （3）划线时，每次都要将接种环上 多余菌体烧掉。 （4）培养皿要贴标签，包括班级、 姓名 恤 掣 厌 稚 歼 涅 焙 练 煎 捅 荧 尉 亿 总 缺 绥 驮 蔷 络 粱 扫 宜 钾 烂 瑞 朴 袒 逛 佃 慷 思 协 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 六、思考题 1、分析阿斯毕培养基成分，说明其 适用于分离自生固氮菌的原因。 2、划线分离时，为什么每次都要将 接种环上多余的菌体烧掉？划线为何 不能重叠？ 3、如何从自然界中分离自己所需要 的纯培养？应注意哪些问题。 株 肺 尸 沃 惶 澎 菇 盎 杠 查 劝 彼 俭 蜂 敬 橇 诲 糜 盔 宋 楚 垢 腿 妙 为 唉 梗 撵 顽 峨 咋 俯 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术 第 三 周 微 生 物 分 离 纯 化 接 种 与 培 养 技 术