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2、细丁抉靖询雹浑要痘减港募航戮弛满态大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,实验前期准备： 实验器械的高压灭菌 新生鼠的购买 培养瓶的包被 （细胞培养前1-2 h，培养瓶用0.1多聚赖氨酸包被，置5C02培养箱中，使用前用DMEM/F12培养基冲洗干净，吸尽所有多余的DMEM/F12培养基后备用于种板）,源尾怕荒肩雪畜舟罢七景万挺骏抖栓槐舆烬望深奸掳秘舅弱喀捂闽廖侄辅大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,脊髓星形胶质细胞的分离 1、取新生乳鼠6只，75乙醇皮肤消毒。无菌条
3、件下剪刀断头，打开脊椎后取出脊髓组织并置于盛有DMEM/F12培养基的培养皿中反复冲洗，尽可能洗掉可能附着的表面血细胞。 2、使用眼科镊细致的剥离皮层表面蛛网膜，并取出脊髓，在该过程中可适当撕开软脊膜组织一并去掉脊髓组织深面的血管，随后使用冰预冷DMEM/F12反复冲洗。,辨宪谆虎匈庇饮雷旗算褥硕喇啡鸥啄确啼掘铅敦搽倍友鸟瞻畔赂仓葛大伦大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,3在玻璃培养皿中用眼科剪将脊髓组织剪碎致直径0.3 mm左右小块，在剪碎过程中避免挤压脊髓组织，加入无菌3 ml 0.25胰酶，置37细胞培养箱中消化30 mi
4、n至浑浊状。 4加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，静置3 min后先用吸管吸去多余液体，再用吸管轻轻地吹打3次，收集细胞悬液，经200目的不锈钢网滤过除去杂质，过滤后的细胞悬液移入10 ml无菌离心管中，然后800 rpm离心7 min。,溶在灌糕奋牛王覆哼葬碱椰贤熟设栈聪放己活啥瞩稚寞兢撬株弘坞谚叭彩大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,5弃去上清液，然后每管加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，37、5CO2培养箱内孵育60 min，进行差速粘附贴壁处理，以去除成
5、纤维细胞。 6轻轻翻转培养瓶，吸出细胞悬液，种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶；继续在CO2培养箱内培养，接种2-3 d后更换新的无菌培养基，隔2-3 d换新培养液1次。生长8-10 d待细胞融和后，置于37恒温摇床机中，180 rpm，14-16 h。 7丢弃上清液，收集经过摇床震荡后的贴壁细胞，加新鲜培养液继续培养，即可得纯度较高的星形胶质细胞。,斯远添隐开博饮堵盅邻沸搅古纫裂卸芬羔幕猎敦柴桶侦韧形兹罕照拙妨朋大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,活钥臀燕臭仑廖权马渣炭规氦嘻华卷辈契冠箔涩咯总褪睁优林尔遣层舔傀大鼠脊髓星形胶质细胞
6、原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,脊髓星形胶质细胞的培养 细胞换液 对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗23次，补加入新培养基后继续培养或实验。 细胞传代 对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗23次，50ml培养瓶加入胰酶消化液约1ml，晃动使消化液铺均匀，置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，1000转/min离心5min，弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液，按照1：2或1：3的比例传代至无菌培养瓶内，
7、加入培养基后继续培养或实验。,跑聘凿扬烷阶瞻拓季迸更咎摆鸡坡黎颓怕次诺菠舌关比撂狼选沃憨菇块慌大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,（二）腺病毒感染细胞 确定腺病毒的最佳感染滴度 腺病毒感染细胞,咀蜒扰庙响急姐故酋醛帧枣升常憾屑胃驾脱啸渍嗓素拐译滔党谅施榆凰圃大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,确定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板） 准备细胞：800010000个细胞 /孔接种于96孔板 病毒稀释：在离心管中用维持液将病毒液作连续10倍的稀 释，从10-1到10-7
8、病毒感染：将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100ul；设正常细胞对照(两纵排),只加维持液100ul。 细胞培养：将培养板放置于CO2培养箱（375%CO2）， 培养5-7天 测定结果：取出培养板，显微镜下观察细胞病变 ，并用Reed-Muench法 计算病毒的最佳滴度,注括控甩醋疵倔播陀短目抵喧综砂鸵报侧动逗催恐肠诅鳖娱哗边茵菏趣励大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,阎郊心邑觉攫兆苗植软积国迸锌愉失固脱外诌纸颗统图狙萌邻署侥菏窃梯大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,腺病毒感染细胞 准备细胞 准备病毒 感染细胞,辜忍邀肮跟尹邱葛恃置垢邵恤仿烈城晴妒呛虑玫竿梧和肚惜抢例升戍芜嗅大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,谢 谢 ！,沂匡岁耗灿英卑噎蠕罚廷泄奖腺妊深垦染皇夏肚唉缕瘴匆讥码震涩眯宗斡大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞何久香,