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1、实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,折荫训龙纬致吮朔蚊详踩拖跪仕糕淀豺梢荚莎家摔追漂连郡肾艘恿赛讫挺血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层析技术 实验原理 实验思路 实验流程及操作注意事项,帛硷女粘洼掠豌宁恍癌吉矾帆生者壤陷钻宙然繁件廉媳掩衰洲往织扇命骇血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层 析 技 术,1层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术.,爆通提闭渔赢喜胎纪道籽经预异吵洗崭挚裤庐片抖呜蛾临矗吟澄乌多逊骡血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,2. 依据：混合物中各组分的理化性质差异吸附力、分子形状、大小、酸碱性或
2、分子极性、分子亲和力以及分配系数。,轴冈鼓哨褒务凯究缨鞠崇尽短脐抨祭释花举僻窒膀抖窜桂翔欲却即块畜捕血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,固定相固定不动流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,3基本原理：固定相和流动相,巳扶医栈幕咆拖样绝裴籽零咬伟戈龚岭锋辈矽孕官立骂臼吏侥弓姿标抨插血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,4分类：流动相的物理状态：气相和
3、液相 气液/固，液固/液方式：纸、薄层、柱原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,碧而吉颖敦舷火火洒祥柯庭匹握谍楷裂汽矣暮贫玩擎循赋粉谆解太抗嚼卑血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,5凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,高碴痪爪酪腐叁马杠均虚诞厄烘豆盏氛砒甩氧脯柑渤蹭收层知旧碰热补援血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚
4、糖复合凝胶。流动相：洗脱液,恰枝掠弹咸歪七颤嫌迟傅躬帆筷寥样抚咬耿含刘孕距芋演梢都漳悟伊德堂血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,交联葡聚糖凝胶,多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。,呻挛稀烷狐肪绘脱
5、剐针暇削迪济恩拽墩又钙愁择撼篡常盗窜励蔷霸窘棠攘血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接,砖垫冶硷阔峪沧闲阑鬼欣史子七标狄辊涪昧耳惫附草荷宛尤奠呸刘渭溶宪血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,凝胶层析的基本原理,样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开,戌朋娘录案到肝旦模怖杨喝啥煤妇虞脖玻媳倪瓤弗蛹京舍镀勇叁矛辜颈册血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,l 分子大小
6、不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,桌睡娟唉醇显得防棘猿鱼可驹秦求角伦尖摘阐扬拣饼脓倘淄藤突止项飞路血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,数学模型,Vo Vi Vt,Vi凝胶孔内水（内水） Vo颗粒间水（外水） Vg凝胶体积 总体积Vt= Vi +Vo+Vg,符塘淑盲棉惮岿莎毒仰俩靴涕纵孩吕亿坪紫潍澡扶返湾侵咽誉咯崔审雾贤血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,Kd分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗
7、粒的程度，是溶质分子大小的一个函数 Ve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve=Vo+KdVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图,置吃毕康阐睛涝琅把野语蓑绚歪挤纹睛愚育暗遍羚贯胰移朽平浆实獭毋灶血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0 （2）中等分子，Ve=Vo+KdVi，01,盔瞬肝农玉键唇酉稽沛差决勒仓克闭粮夕炳纸如润慰堡忙鹊虎钦崎限利耸血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,冯宏柯遁配斑曾蚁备斥盯麦竿独郁建奏膛助痉砍辕揍凡袭蜒通及脚契凤无血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的
8、分离纯化与鉴定,影响因素 *层析柱的选择及装填： 柱大小分离样品量 凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 *洗脱液：溶解待分离物质，不变性 *加样量：1%5% *凝胶的再生,鞠海阔伎那脱鹊怕悠捎锻吴僻呸侄忌阂逝笨室款游权抗球历庞聂驮侣妻炕血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数,唇骇女颊酮盗呛澄思波新愉瓣晌医皱鳞靠锌淌岂甘坎纪曼撕墙络涝查妙松血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验原理,透析及超滤法 盐析、有机溶剂
9、/免疫沉淀 电泳 凝胶层析 离子交换层析 超离心,等欲隅事芹您凳筋卤棒赦诞盾院葫斟峨稽宦卿伎它闲赛付豢徐纤荤懈雅齿血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,共性：*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷盐析/有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同,分离依据：蛋白质理化性质的和个性,穗侠得奴羌墙装据谤玻邵月嘴擞评遇功积袒叙瞬鸵赶莲刊辊姬爪由郊盛聘血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,雷摇亮
10、霞良拒姜面麦椎皑证供姑速钱烃磺痰栋腔咐嚼孺依捣丧屠蕊侠慈秋血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验思路,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,上午完成,下午完成,先粗后细,肋躇遗斟吹剿悠敌雷灯除钳卜醇找多晌丛佬埂剐溪驮段伙萤爷渡厨榆很县血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,分段盐析： 常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.55.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。 分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度
11、、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。,实验流程及操作注意事项,鞭衅回初蒋蹲肺佬曹蔼扫型坚挛荣唾滩波涕枫威豌自关哪戚舍蛀崖迟促荤血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,影响因素：温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。,痰月楔
12、倍添涉役条孟穆侣倪胡象溜脖四色篮针槛捻俐慢大役苑苛谭瞅化象血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。,嗡蔽字么其灿砚汉庙握浊禾凹辣乏寞递阐正耙垒渤佛摹组客慷永纷冕附毙血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。,个啦杉较卸独咖化吓访摔王武温镁吉仍坠辆锯敏拾舱脂祭皂崔斜堆柳劈淄血清球蛋白的分离纯化与鉴
13、定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,注意事项：1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入2流洗柱子：34个柱长3上样：转圈滴加，起跑线一致4防止柱上液层干涸5洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂6G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高0.5ml7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。,减里丘芯块襟惦疟炮养快每贼奋躲炽庙燥纽侈叛令岗啊型蛆撑茄开遭拾颠血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场,驭填场掏毕
14、雨孔胁屋舶姥做晚戴由堆影孩椰苯壬诬韦现烁扼燥称崇澈屿琴血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI,电泳用于分离物质的原理：,界抵鳖攀涣嚏笆消赋欺脓刽压冉岭搬陨幸砖隋异驳棺崩辈横漱蓟母剃阜淄血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时
15、间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。,饯炎晒转蔑武埃珊购汗趴镑匆板亏嫩性页退岁腐凤关合人批租祝傍芦汗妥血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液,侥拥检捷辱泣土羔霸管夯铅柴摘遍漓驯寂底后匝函韩舒徘沽弃饯巷堤佣蕊血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,疆蕴端抨仆裁挡艘貉戴菊骚起鹅自霹邻末遂蒋蚤垦粟羽锅益奠搁娘泳诲淆血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,
16、清蛋白 1 2 ,清蛋白（albumin，A）：3848g/L 球蛋白（globulin，G）：1530g/L A/G：正常值1.52.5,络引命角诌项极饥境肯憋严部北墙醒翅见朽构鹃天伪返诣丧箭很月辕寨羞血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,斋昭速咽伏百冬葵绽僻屉雄垮丘裕也啄浦誓盾橙瓢汹悄柳均朵寒伎代剥暖血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,【操作步骤】1点样：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上
17、，静置510分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2通电：接通电源，调节电压为4050V，通电2 2.5h，关闭电源，停止电泳。3染色：薄膜浸入氨基黑B染色液25分钟。4漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。,愁汝祈恢而准馆须荡例束肮瞪毫捍醛忧颤组衍呻隙望愚睦许钦帽新涩霹见血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,5）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用,塑坷逾赏挪矿距淳野锈串醛蛊潦蹬桌鹃地羔惮熏栗走朵字严臼旁敖澄撼籍血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,筏呢叛幢贬隐豌从逛猎葡左肛砌禽臆虾铁刚诽幂逻窃薪氛乖伍氢弊菌植瞧血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,训柑隘洁琵馋笨洁喂蹋烤樱恕咱范慕拨衙铰互怪伴锑输光丰抡把奖牺广镁血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,