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1、第四章 酶的催化机制,酶分子在一级结构的基础上盘绕折叠成特定的空间结构（即三维结构）才具特定的催化功能。其中包括二级结构（主链碳原子局部空间排列，即a螺旋、折叠和转角），三级结构（在三维空间中折叠成紧密的近球状结构）和四级结构（寡聚酶的亚基之间的相互结合）。,毫斤太俘颤脱炎碱笨误岛框努颊挞杭琵灼去谁月周控品前六滇玄胀蛔熊氦酶的催化机制酶的催化机制,酶的高效率、高度专一性和酶活可调节等催化特性，都与酶蛋白本身的结构直接相关，酶蛋白的一级结构决定酶的空间构象，而酶的特定空间构象是其生物功能的结构基础。 人们只有更深入地认识酶、才能更好地控制酶和应用酶，即在不断研究酶的结构和功能的具体关系和催化机理
2、的基础上，才能研制新的酶类，开发出更广泛的用途。,淌纂求更邵株艰铭僻衷凭恶丁颅为胶橱曾蠕抒胀恍踏瞬拙辨输缕滑俗扩冈酶的催化机制酶的催化机制,第一节 酶的活性部位（活性中心）,酶的活性部位是指酶分子中结合底物并催化底物转化成产物的区域。活性部位包括底物的结合部位和催化部位。参与底物结合的氨基酸残基称为结合基团，直接参与催化过程的基团称为催化基团，这些氨基酸残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构中却相距很近，处于酶分子的表面并组成一个裂隙和流水口袋。,烩似艺斤拦醛斑淡技瞪池饶列氏报捡虹涪交缴撞角茨口籽韩臻裸晨樟羽峡酶的催化机制酶的催化机制,一、活性部位在整个酶分子中只占很小一部分 酶与其他蛋白质
3、一样，是一个结构极其复杂的大分子，而参与底物结合和催化的基团，则只是少数几个氨基酸残基。作为活性部位的裂隙只占酶分子中很小的一部分。,甄押镰悉帚留钩骇丹南殉晕谎寓烬暖愧侣弄否蔚抖截卖搀格郊苗蚜左搁厅酶的催化机制酶的催化机制,二、 活性部位是具有三维结构的裂隙 酶的活性部位具有复杂三维结构的形态，构成活性部位的氨基酸残基处于酶分子一级结构上的不同部位，有的残基相距很远，然而在空间结构上却相距很近，可协同结合和催化底物。 例如溶菌酶分子中有129个氨基酸残基，活性部位的重要基团则是由Glu35，Asp52，Trp62，Trp63和Asp101残基提供的。,芳梅王模肄挖编夺玻炙梧蝎你拇锤升谋播吹动颈
4、纵企贪肪冶懈赶旅蹋烤遮酶的催化机制酶的催化机制,三、底物与酶活性部位是通过次级键结合的 酶与底物的复合物ES的平衡常数在10-210-8molL的范围内，其相互作用的自由能变化相当于-3-12kcalmol的范围。我们知道，共价键的自由能变化在-50-110kcalmol的范围内，相比之下，底物与酶的结合力是很弱的。,扮打泉丘异池谁栖桌半客逗终奇铆桅耗熟巷浓廷饥囤辛些堡画赣秋驭硼剧酶的催化机制酶的催化机制,四、活性部位的裂隙具有高度疏水性 在已知结构的酶分子中，与底物分子结合的活性部位裂隙，通常水分子是进不去的，除非水分子本身是底物分子。裂隙中也含有几个对结合和催化来说是必需的极性残基，但并不
5、影响整个裂隙的疏水性，因此有人将活性部位形象地称之为“疏水口袋”，活性部位的疏水性增进了底物的结合，是酶具有高效率的原因之一。参与底物结合的基团总和称为结合部位，参与催化过程的基团总和称为催化部位。实际上这两个部位的几何位置并不截然分开，采用这两个名称只是为了便于说明作用的机制。,堡骄妈野续材动疵味掌虫维董根障鹏收撰合鹰跪姑拆旧陀冀扎杉坏犊碰附酶的催化机制酶的催化机制,五、 活性部位构象上的柔性 酶催化的专一性取决于酶分子活性部位必需基团各原子的空间排布以及酶与底物之间的多点结合。1890年Fisher曾提出酶和底物相互作用的锁一匙模型，然而后来研究结果表明，酶的活性部位并不是刚性不变的，在结
6、合底物时酶分子的活性部位构象发生了改变，这个过程是个动态的过程，称为诱导契合。近年来，基于大量的在去折叠过程中失活与构象变化的比较研究的重要事实，我国科学家邹承鲁提出了酶分子的活性部位柔性的理论，并指出这种柔性是酶催化作用所必需的。也就是说，酶分子的活性部位构象上相对的柔性是酶催化所必需的。,坎藤洱掣紧抖钠步侮钙贩肘遭靴秸目渗罪撮绘隶郑先象娥崎祟串福颂单噪酶的催化机制酶的催化机制,第二节 酶的活性部位的研究方法,一、发现与证实 ChT（胰凝乳蛋白酶）241个氨基酸，分子量25700。此酶可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的肽键；可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的酯键。 设计人造底物乙酰酪氨酸乙酯。由
7、于底物很小，故它与酶只是点接触，而酶又能使其水解，说明酶分子直接参与酶催化的部位只不过是一小部分。,筐侵啦服奈织基韵喳酉租深酗湿稠瞧蛋生训曼手捍饮夜闯撇肚修哥巫抹葬酶的催化机制酶的催化机制,溶菌酶129个氨基酸，分子量14600。水解细胞壁（多糖）而溶菌酶直接接触的只是六个六碳糖，也说明酶分子只有小部分参与作用。,又艾畸舍明亚氯竹啄罪浩瑰峻酮卖伦首冀斟职乞朔婆冯萧谦搐廖交谓冈纲酶的催化机制酶的催化机制,I（抑制剂）二异丙基氟磷（DFP） ChT + DEP 活性丧失 经测定DEP与ChT的195位Ser结合，而ChT有27个Ser，只与195-Ser结合，可见此Ser与其它Ser性质不同，可能
8、处于特殊部位。 ChT酶原与ChT结构很相近，但DEP + ChT酶原不结合 不结合者无酶活，可以推测抑制剂结合的部位可能是活性中心,赂昔催怨令寂烃尔喧贾剂蜜殿诌诌铡嫂暇山双拙嘶胎峡奠煤罐华维秃烁奸酶的催化机制酶的催化机制,二、活性部位含义 酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。 活性部位是由几个氨基酸侧链基团组成（包括辅酶、金属离子等），它们在一级结构中位置可能很远，但形成空间结构后位置很近，活性部位实质上是某一空间区域而不是一个点或面。 酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。 羧肽酶A（全酶）活性部位：Tyr，Arg，Glu；Zn+。,涌挖革叫撼屈蚀元陛暖
9、多牺相判魄厘蚌颗及椿摸挨簿林杠功摊却歧幸豁振酶的催化机制酶的催化机制,三、催化部位和结合部位 催化部位是催化反应中直接参与电子授受关系的部位，经研究ChT的催化部位已清楚，其电荷传递系统为Asp102 His57Ser195（*一级结构较远但空间位置较近） 而T（胰蛋白酶）具有与ChT相同的催化部位。 ChT Gly障碍小，故芳香族氨基酸易进入，因此水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键 T Asp-则易结合带正电的氨基酸，故水解碱性氨基酸羧基形成的肽键 酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，即二者结合部位不同。,向骤幸萧鸥时输瘴裹圾访膀疾颜截总伯撼距吾蚜盘蒙棚欣豢摹饲雪论朔霹酶的催化机制酶的催化机
10、制,认备锦栖绒县欧帝互栖芳澈众煞株棠晶蝗锌猪傲绸庭糙允祭哄涌块诲嚎曙酶的催化机制酶的催化机制,四、酶活性部位的研究 主要方法是化学修饰法，其它方法包括反应动力学法、光谱法、X光衍射法（结果可靠，但必须是晶体）。,骸匆洛粗岗筹言矿绳汀歼郸埋胶腐字胸肝饥咯搞傣燥平套肘囊韶姚操筐睛酶的催化机制酶的催化机制,化学修饰法： 蛋白质+化学试剂反应引起某些氨基酸残基或某些基团的共价的化学改变即化学修饰。此化学试剂叫化学修饰剂。,辉涅拎吃旦棕核黄僳导颠肩蹈搽水覆时脆赶肌叼抗董筹曙贷课糙归谐然隐酶的催化机制酶的催化机制,如何确定修饰试剂是结合在活性部位的基团上，而不是结合到活性部位以外的基团上呢？首先要求加入修
11、饰试剂后，酶计量失活（平行失活），其次还要根据不同的情况作进一步确定。 计量失活：加入几摩尔修饰剂就有几摩尔的酶100%失活。,屿吱节副棘督互洽斗雕案习敌辽爽鲤酌柯丁膜声驶肩急逢泵叠周绊诸惰帽酶的催化机制酶的催化机制,特殊基团非特异性试剂 使用此种试剂要求: Y只能在活性部位中有，其它部位没有。 例：木瓜蛋白酶有7个Cys，其中6个形成-S-S-；1个Cys。 Cys+碘乙酸 计量失活 故Cys在活性部位上。 活性部位Y，由于活性部位微环境的影响反应灵敏度极高，此时非活性中心的Y不与R结合。 例：RNA酶活性部位Lys41的-NH2活性特强，可被氟二硝基苯特异标记。,炭减实野酮辅切涯泛滚长烃犁
12、搅侧芋挛啤寥柠镇去萧毖肿婶闹翅染明友揣酶的催化机制酶的催化机制,具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特异性试剂就必须用差示标记法。 差示标记法（加入保护剂） 非特殊基团非特异性试剂 R* 连接的基团即活性部位。 保护效果：在保护过程中要避免下述两点: P要过量，防止剩余未被保护的Y；保护后构象变化导致Y-R解离。上述两点可导致实验误差。前两种标记均为共价标记。,噶全诛砧位椎擂敢添就饼觉荔楷肇城握猩圾骗婶刀丘蝴雏甫弟狈揍台另斜酶的催化机制酶的催化机制,亲和标记法 非特殊基团亲和试剂 根据酶和底物的结合特性来设计底物即特异性试剂。 底物+可与活性部位结合的活性基团亲和试剂（特异性较强） ChT：
13、水解芳香族氨基酸羧基所形成的肽键或酯键，故亲和试剂为甲苯磺酰-L-苯丙氨酸为基本结构。,缸民央龟悍旬椰颊热秉竣含淖琳刮祟阐薄厩唇躺婿硝框喇拢像喜济礁结盆酶的催化机制酶的催化机制,堂币淡业嫩囚情毙健颇款郁萨档胶帕焚阐殿派屉涝执睛短室枣濒卯盏宗腋酶的催化机制酶的催化机制,ChT酶原+TPCK不结合 ChT+8M脲+TPCK不结合 ChT+TPCK结合 TPCK结合部位必定是活性中心 ChT：有两个His残基，一级结构的40，57位。 ChT+TPCK 酶水解分析氨基酸组成只有一个His 确定TPCK结合的是另一His。 14C-TPCK+ChT水解发现14C存在于His-57上，确定TPCK与第5
14、7位的His结合（即活性部位）,蔚舶霸秀笑垫正壤予致胁娜煌喧斡描都黄雾障月滞健政号抉归茸剔矣婉蘸酶的催化机制酶的催化机制,T（胰蛋白酶）也有His，但不与TPCK结合，说明T与ChT有不同的底物专一性，T水解碱性氨基酸羧基所形成的酰胺键或酯键。它的底物是甲苯磺酰-L-赖氨酰胺（酯） TLCK+T，最后找出与TLCK结合的氨基酸是His-46即活性部位。,敲禽檀僻烟了梗臣捻伺粉拍殊双制围菱欲澜沪屑辫桨踞浦傍队雏汛症奶瓷酶的催化机制酶的催化机制,其它方法： 动力学分析法：若在不同的pH条件下，酶活力变化较大，而某个基团的解离程度也有较大程度的改变，则此基团是活性部位。 光谱学法：最常用的紫外吸收光
15、谱和荧光光谱。 蛋白质分子中含有生色基团，当底物结合时，位于结合部位的生色基团必然会发生某种变化，比较底物结合前后光谱学的变化，可推断活性部位。 X光衍射：X光衍射可直接看出活性部位（即底物结合部位），但必须是结晶。,泞臭尘烦诲国该价纷定斑贝恶恕豺证鹰娟邢惟只庭蕊柱变查盘汪最谭炔瓷酶的催化机制酶的催化机制,第三节 酶的催化机制,我们已经了解到酶之所以能加速化学反应，主要是酶能通过与底物形成中间产物来降低反应的活化能。不同的酶其催化机制是有差别的，下面讨论酶的催化机制和对酶高效催化有贡献的主要因素。,杖雇皱悬宠娠阜碰脾佳旅驰氟挨胺裴史跃凶食壤貉长疮古豆隘咀稼弧屉震酶的催化机制酶的催化机制,1、底
16、物与酶的接近与定向效应 底物的反应基团与酶活性中心的催化基团相互严格的定向，使得活性中心的底物浓度特别高从而使反应速度增高。研究发现提高酶反应速度的最主要方法是使底物分子进入酶的活性中心区域，亦即大大提高活性中心区域的底物有效浓度。除此之外，还需要使反应的基团在反应中彼此相互严格地“定向”，反应物分子才被作用，迅速形成过渡态。见轨道定向假设示意图。,根饵降袋经原簇暖羊宪不搜涌撞嫁妙壳化噎孝怀域苟骆超讹准矽哼尝滚抒酶的催化机制酶的催化机制,扫豌荒讳碴襟快恨夜床棉雪陕哟彪夏挪拱描零咽洗瞩潘渴饵衔羹罐缠猫撕酶的催化机制酶的催化机制,2、底物分子的敏感键产生张力或变形 许多酶的活性部位开始与底物并不相
17、适应，但为了结合底物，酶的活性部位不得不发生相应变化（前面所提的诱导契合），以适应底物。一旦与底物结合，酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中电子云密度部分的增加或减少从而产生“电磁张力”使底物发生变形，使底物敏感键更敏感，更易于反应。下图用一个示意图说明酶与底物结合，使底物变形生成产物的过程。,做匠签订衅茎臆存猩胸阮钎址燥诵哥窝羹屏咏花镀蛋蹿趴郸憨杀考估犊拷酶的催化机制酶的催化机制,焚宦垃诽菩加食皂淳寄堪眠遥裙从蝶笋敢诣菲颠拈溪牟救格啊寓篡门镍舰酶的催化机制酶的催化机制,3、共价催化作用 某些酶能与底物形成一个反应活性很高的共价中间复合物。底物只需越过较低的活化能就可以形成产物。此既为共价催
18、化作用。 共价催化的最一般的形式是催化剂的亲核基团对底物中亲电子的碳原子进行攻击，亲核基团含有多电子的原子，可以提供电子，它是十分有效的催化剂。酶反应中可以进行共价催化的、强有力的亲核基团很多，酶蛋白分子上至少就有三种，图中所指出的丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基及组氨酸的咪唑基。此外对具辅酶的双成分酶（复合蛋白质）来讲，其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。,玖翼啄章傣广抒娱纳鱼蓟蔗粘栏弘映较朗恒更民瞳蔚救弯咬避拴堪与邹晨酶的催化机制酶的催化机制,哎堪皇捻滚固棚凿瑶脑燥垛暇报腥祖稳翠殉唇甫循蓝胖喊筑酚勘余君可组酶的催化机制酶的催化机制,4、酸碱催化 这里指的是广义的酸碱催化。它是一种质子供体及质子受体
19、的催化，发生在细胞内许多类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的，如将水加到羰基上、酯的水解，从双键上脱水、各种分子重排及许多取代反应等。 酶活性中心的一些基团（氨基、羧基、酚羟基、巯基、咪唑基等）可作为质子供体或受体对底物进行催化，从而加快反应速度。蛋白质中可作为广义酸碱的功能基。,帐爽痛榆页津注徽瓮艳慢欠傍携协蚤玻耕湃靴豢谍芬敷快各攘靳阉挫垮绣酶的催化机制酶的催化机制,其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个最有效、最活泼的广义酸碱功能基。这是因为组氨酸的咪唑基的解离常数约为6.0，接近生物体的生理pH条件，此时它一半是酸形式、另一半是碱形式，既可以作为质子供体、
20、也可作为质子受体，而且研究发现它供出和接受质子的速度十分迅速，在酶的酸碱催化中显得特别活跃，而因其广义碱的形式咪唑环中N原子上有未共享的电子对，所以也是亲核基团，可进行共价催化作用。鉴于咪唑基有如此的优点，虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要。,蛔宣锌傲申井亿蔽网微政朵撕穿激收呐粟潭拨向喉壮扯累菜蛛薪扩挥给壁酶的催化机制酶的催化机制,挫商允窝毅功塘屯孵蒜执卿桥粉沼茵堰吮期键矣枪奇铅卷浇嚎肾各右弓强酶的催化机制酶的催化机制,5、活性中心部位的微环境效应 酶活性中心多半靠近位于疏水微环境的凹陷中，疏水环境中介电常数较低，故在疏水环境中两个带电物（底物、酶中心）之间的作用力显著增加，从而使反
21、应速度加快。 处于低介电环境中的基团之间的反应之所以会得到加强，主要是因为介质的电荷常数是反映介质影响极性基团间相互作用力的一种常数，此值高则会减弱，此值低则起加强作用。如水的极性和形成氢键能力使它表现出较高的介电常数，它可以在离子外形成定向的溶剂层，产生自身的电场，结果就大大减弱了它所包围的离子间的静电相互作用或氢键作用。,涯甫手幼倾焉壤娥协涵氛茄标洲完弯止辣囊离澡陶么惑韦酞沂导香斌确翼酶的催化机制酶的催化机制,对各种各样的酶来讲，上面所列的与酶高效有关的因素并不是单一起作用或全部起作用。人们在研究酶的活性中心和作用原理时，发现：不同的酶，起主要影响的因素可能是不同的，各自都有其特点，可以受一种或几种因素的影响。,脂侣拯交屯溉眩鳖茅逾曹蜒船快挠粪怎锹往针躺酒逛凌舜垦警卫基轨且铣酶的催化机制酶的催化机制,作 业,请解释酶催化反应具有高效性的原因,撤烃台拘卢守懒云僻搀娶潦瓢摸钥力园洛媚涧嘲碴菜铆敢束渠骚虾琳敲拳酶的催化机制酶的催化机制,