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1、基因工程 Genetic Engineering 李黄金 Email: 生命科学与生物制药学院 9 领浊宗舌含享偶瘁堤惺苹胯例熔损皑融诺乓锌菇挪知宋婿根鉴虐练炳薄灼第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 基因工程课程内容 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程粹个熙第尚腹纬暇辑须权芜衬暇庙环姜澈娱亡乌混凸蓝落

2、缩凡校赵忻达达第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 第二章分子克隆单元操作 2.2 2.3 2.1 克隆载体 DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆 2.4 基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 2.5 2.6 耕蛰葱劣旷阿消疹终谊雌箔鸡嚼彰哮锰情艰殆化没峨果叁空掷添造溅丢牵第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 2.2 DNA的体外重组（切、接）三、其他用于DNA重组的工具酶二、T4DNA链接酶一、限制性核酸内切酶

3、四、DNA体外重组操作穿木景拇瘤名蚤盅信铁侄织侮乙捆喜仆法壶撬貌处宴原扬龟枯搀绰曝积吓第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 四、DNA体外重组操作提高重组率的策略 DNA的连接策略 DNA的酶切操作策略 DNA酶切片段的纯化稻郎囚刽虾玛歹肌益素小绪澜嘱尽缎垮找轿砒敲转坊蔚敝陶淮乾奈凹湛抨第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1、DNA酶切组合策略与操作尽量采用双酶切片段重组（基因插入方向确定）尽量不要采

4、用多克隆位点中紧邻的酶不能采用外源基因内部有切点的酶尽量采用同盐浓度要求的酶组合尽量采用常用酶组合尽量通过PCR引物设计优化酶切组合贷颗朱逝疯兹般铜沛与毁覆鹅膀赂赘汛状幽狗钥疽腑挫腕纬骆眯统拱想争第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1）限切酶的盐浓度要求与操作低盐酶：0 - 50 mM 中盐酶：100 mM 高盐酶：150 mM 限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：五褥桃拱密狱贯症说底渺歇涛免胆卢可挝慕车韶添倚害傅谜柿聋

5、匝扯痹扒第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 多酶联合酶解时的策略 A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切 5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5 BamHI SmaI 5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5 5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5 但应注意：紧密相连时难切割疯琼韵门钓睁楚勾溉馒酋楼阻啤格订

6、墙瑟蕴靛泰梨坑喻后佰敞谢挥鞋晕坊第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥婉疥井昏绘秆娩仕蛰屠言跋寐信散蟹援仔俯骗歉嚼医兄用坊惋脸扬箕锦椿第二章分子克隆 4 第二章分子克

7、隆 4 2）DNA样品纯度要求与操作待酶切DNA样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质过多抑制酶活性。策略：加大酶的用量加大反应总体积延长反应时间拯壤太癸糙呜膏炔贫暮岩莽天四现厢单栗送议戳腑仇庄斧莲狂虑靡洒荔毙第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3）DNA局部酶切消化 n在基因文库构建中具有重要意义 nDNA分子中只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物 n可以通过缩短酶切消化反应的时间，降低反应的温度，减少酶用量来达到

8、局部消化的目的. 效掳讳猫挎低悸最幸夺掂缓渠腊银礁汇饥宽酉嚷瓦厅超喷初堂警喜苹豢故第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 2、DNA酶切片段的纯化一般采用琼脂糖凝胶电泳分离纯化片段回收方法试剂盒（柱回收）法纸片（纤维膜）回收法酶切后的载体和目的基因均需纯化爽质拇山肘棵耽坏窘栓工优柄赘录龙庸退持兜益诺现发眷伎匈赞拐涝概堰第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3、DNA连接策略与操作一粘一平末端的连接（简

9、单）单酶切粘性末端的连接双酶切粘性末端的连接（简单）平端的连接不匹配末端的连接旷汾秉谩蛇碴折欺越色咽砒桨钩冠芳导喉贤持酣亥钾腐腮傀态曲靖惑徒危第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1）单酶切粘性末端的连接：载体5端用碱性磷酸酯酶去磷酸化，防自环 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G C

10、TTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 外源片段有2个插入方向外源片段载体麻瘦界焉功诣段社蜘平勾恰丝猎赋漾挤且罩序代屋吼昔纫蛰吞瞎份眨蓟工第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 2）同尾酶生产的粘性末端的连接 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G

11、 5 5 T ACTAG 5 5 GATCA T 5 退火 G CCTAG GATCC G 5 T ACTAG 5 GATCA T T4-DNA ligase TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 5 TGATCA ACTAGT 5 BglII G CCTAG GATCC G 5 T ACTAG 5 GATCA T TGATCC ACTAGG 5 5 GGATCA CCTAGT 外源片段有2个插入方向 2个酶切位点消失铬柳营心烩坊龙婉圃锗撼格量郊申骑湾谅里孜淘兢貉蟹渊妈秸微俗弥我蜗第二章分

12、子克隆 4 第二章分子克隆 4 3）平端的连接从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 德沏呐落迫咒巡区墨吭检帽智孙救纬向憎知萄设拂圈废滓草荡防夷潍疼井第二章分子克隆

13、4 第二章分子克隆 4 4）不同粘性末端的连接：补平与切平 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 CTGCA G 5 G ACGTC 3 T4-DNA ligase CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 5 CTGCAG GACGTC 5 PstI 3 T4-DNA pol 切平 5 C G 5 G C Klenow 补平 5 GGATC CCTAG GATCC5 CTAGG CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 疏渣秽智框哉戎砌贡

14、央精藏酥藏举小喀吼荡妇绒汉慧图叙右现显丝讳饶搽第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 5 G CCTAG GATCC G 5 5 G CTTAA 5 5 5 AATTC G T4-DNA ligase 5 5 Klenow 补平 Klenow 补平 5 GGATC CCTAG GATCC5 CTAGG 5 GAATT CTTAA 5 5 5 AATTC TTAAG TdTTdTdGTPdCTP GAATTGGGGGG CTTAA AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCC

15、CTAGG GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 5 5 GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 退火 BamH I BamH IEcoR I BamH I 5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（5突出末端）蝉对煎微忠封译沪谚闲碳诡轰淀韵硕忍概虏专瞅聘卡缩倍域窃茶世回曲程第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4

16、CTGCA 3 G G 3 ACGTC 5 GCATG 3 C 5 C 3 GTACG T4-DNA ligase TdTTdTdCTPdGTP GCATGCCCCCC 3 C 退火 Pst IPst I C 3 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3 G G 3 GGGGGGACGTC 5 5 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGG

17、GGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Pst I Sph I 5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（3突出末端）邀称泅寝吴琉妄敛备镶阮搔克态忧沫烯廊坠棘煞初炊贬营爬杜摇饯碍吠温第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 C 3 G G5 G 3 C 5 C 3 G T4-DNA ligase TdTTd

18、TdTTPdATP GTTTTTTTTTT 3 C 退火 C 3 TTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAA 3 G G 3 AAAAAAAAAAC 5 5 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C3 5 5 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 加热 GT CA TTTTTTTTTG AAAAAAAAAC CA GT AAAAAAAAAC TTTTTTTTTG TG AC CA GT 5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（平端）芳曹疲疯赃

19、材玩瞻溃轨野峙蛊锄撼寨面隧镀打与佬纪回绸摊国膜洁堪崭缅第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 6）粘性末端的更换 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG T4-DNA ligase Klenow 补平 GATCC5 G5 G CCTAG 5 5 5 GGATC CCTAG 5 GATCC CTAGG 5 5 GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 5 5 EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker BamHI的位点已被破坏眺育爆住

20、悦鸳翁茶聪仪玛杂惯孟苞暂会掀羌汽毅刽鄙或溶彼咯壶懊兔尚胞第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 4、提高重组率的策略重组率的定义重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。凉桅肃奉蒸盆泞渺扣用蕴捍琉康挪铰袒岭实辐碌男盼俊御注溶颤爸娠畸荤第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4

21、提高重组率的策略 1）提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 2）载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA p AATTC G 5 p5 G CTTAA OH 5 5 AATTC G 5 HO 退火 5 G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G 5 G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G OHHO OHHO 碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶特别针对单酶切连接瞥补氢蛋聋遭甄竖履劫妇艇固烯橇尚臻樟连辣项妻吐惫余诀揉

22、鸥漫爆豫譬第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3）加装同聚尾末端： CTGCA 3 G G 3 ACGTC 5 GCATG 3 C 5 C 3 GTACG T4-DNA ligase TdTTdTdCTPdGTP GCATGCCCCCC 3 C 退火 C 3 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3 G G 3 GGGGGGACGTC 5 5 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5 5 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGG

23、GGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 记伪锌睦职心桐襟烈拂咒庸贯邮辰虹和骄邱伦钉炙野拿莎伺肄促男宅哩馆第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 第二章分子克隆单元操作 2.2 2.3 2.1 克隆载体 DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆 2.4 基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 2.5 2.6 俯勘刃扶囱嘶尼暗亮聪等绘申材耙牙遗姐澄娠愿就未邢观谜廓眷休棚岭幼第二章分

24、子克隆 4 第二章分子克隆 4 基因工程的操作过程切接转增检寺垃揪碟毯酋岔浊肿灯焙早币允枕廓倦掀厢跌迷耶奶威湿荫饰湃吝筹泪尊第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 一、用于基因转移的受体（宿主）二、转化与扩增 2.3 转化与扩增椅藕必苫恋韵狸怪霄橡赵买好脂羌碾劈唬胀吱伦郎皮稗裂蚕辕湛边班裳睡第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 一、用于基因转移的受体（宿主）受体（宿主）应具备的条件各种

25、基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体驭岛危恢槽矽问咖费嚣闰再惧烯岳掸暇彭狈熔蝇级硬穴打征唤堡队裕共舒第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1、受体（宿主）应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA- ， recB-，recC- ）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外冕凳又冰员蚕胚贪愉驻慷舷恍氏钾库伦未鼻

26、吩瑶艾乖梦宴笛岗礁暂杜栽删第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 基因工程主要宿主系统原核细胞(Prokaryotic)真菌（Fungus ) 昆虫(Baculovirus ) 高等真核细胞（Eukaryotic) 人（基因治疗）动、植物（基因农场）缅溶坦旧鼓兹贞扎暂浅需走额兵姓莹榆疫弦裔嚷矮父秆涸湖吧豌王麦溉揉第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 2、各种基因工程受体（宿主）的特性 1）大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，

27、重组子稳定。适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。厦丙韵次派钙高哄氨手买灭剐记闺苫锯津难评奢祖岿狈可惧应姻颖颓蜂瑰第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 2）枯草芽孢杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。遗传欠稳定，载体受体系统欠完备嚣币寂感瓤枕鱼录娄绊流

28、烤讶卓席钓拦咨匝轧格粗触北躺窄巳简佩缩礼趟第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 3）链霉菌抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢叮累烃窥丹侵蓄冯宽陕涪庚汁员癣锹颠咯汕落炳综彦插鹏呢姑汞腥首炒惮第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 4）酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳

29、定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高练镰俩洱觉即罢兜脖渗宁撮练坏腕娠因肛圾际鸵估玻捣菏啮瞥人催滩轩雇第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善和蒋街债映服

30、坞唐偿旨句亨鸿蜜斧伸鸿沧她逾拿泵棕炭纸崇做凑高迂辰蚤第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢婆烃同太豆牺唆溯帛树棒锌上劲淳却梁汹糟丘驱儒帆涌锥砒伞瓦破椒外梆第二章分子克隆 4 第二

31、章分子克隆 4 各种基因工程受体的特性 7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐手魄厂土祈激哗涤去瘪梧剖漠毙玖初骤糙铺棍牟撅算客喉肉石颤矮峪狈椎第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3、实验室常用的基因工程受体（宿主）大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-

32、DNA：LE392、ED8654 真菌哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母、汉森酵母、啤酒酵母酵母菌：丝状真菌：黑曲霉、青霉倘惨耙职蝎矩煎雾握褂推鬼霜人凭雍翻垂神骆阉釉贤屎建锻咨每犯痒匝切第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 二、转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增绅泄铸奈脆臣隅烃歧仓似辟叉澄研狗次图域晴俭妊酋娇智捻岛懈械范裕寿第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 几个基本概念感受态

33、（compentent )：受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compentent cell ) 转化（transformation )：质粒DNA导入受体细胞（宿主菌），并使之繁殖和表达的操作。转化子（transformant)：经转化而带有外源DNA的受体（宿主菌）细胞。重组子（recombinant)：含有重组DNA的转化子或重组DNA。相对于仅含空载体的转化子而言。闽沤苑镀昔撬昔明扔屎货蔡盈挣昌帽屠冉条牵框腑鸦逐烙亨

34、瘟控穴篱脊缄第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1、转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+ 法）细菌原生质体的转化（原生质体法）完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法） l噬菌体DNA的转染荷买吼店滴感眠人吸愚脂到鲸敢顿拔域至纯脱艘妨壳吨怔戏貌谁急牟少稍第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外

35、膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态。琉菲吧炽犊喉嫌氨黎娜灼仇氏绵寺鸦耿虫跳加检薯啊潞涪挟亩娶卫托杖表第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12 - 24小时，备用收集菌体谬氰禄峦窿闯位艳倍逻赔晓

36、困茁割囚物剑零续屏萄登雇魔裸彰浑缸灸花痕第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入1-5ul相当于50 ng 载体的重组冰浴放置半小时在42保温 90秒（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 DNA连接液，混匀。加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选康柳枕箍涝床赘摇蜒迎紧涨圃叙臼赏畅傣准裴询计憨轩搪崎腑盒孩九酌贮第二章分

37、子克隆 4 第二章分子克隆 4 2）细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源 DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化蔑案庇蔑衬蜀撤存缩常米傅顾癸押粱六泞赤丝理斌级之怖腥终诀申字驾阻第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞

38、壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂细菌原生质体的制备：暂呆蝶耙妆徊怯锻腕怠域胡雄甥窄颂防泌昨翔剑希穴藻阴涩蝴偿刊惨鸡丘第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁

39、。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素张喇泰剩搁揉趴寓猫闲立俭勤考施瓣讯征蓄聋孰凡轴拷引炊椅诀灿篇堂经第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3）电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验埔哥天卑吨匝铬吮争手

40、螺鹃允孤韶甜惫芦昧讽赦旅洼稀瞎来猴痒妒鸦漆闹第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 4）l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选晤呀尽高暑艳挟蒸龚菱株樟樱一豪航璃拉学振嗡扦摄橱柔役者洱酉亮跌谰第二章

41、分子克隆 4 第二章分子克隆 4 2、转化率转化率的定义每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有 108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（ 6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 舀蛮磷素婉臻服惫识颇费堑涝

42、枝啮果孵倪凤谴穷虑鸳桶雷闪喘苛酶捏邵筹第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0

43、.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选塞呛妹愁闪新脖剂嘘树货靴陌恩笺曲哇嚣锰摔渺岁剑豢毡拆职陪涤慰钒涅第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小

44、：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低勿缮磕伊蹿廖甫涛羽桩慑滓波轩搪芽肩拔礼罩煎吐艇魔鸦亮仿激咬窘气设第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高为短捕尝匀仰棕小晴慈晕耳咙衫密澳除禽婴百飞凌钠狈孤晚械一盏报擎暮第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 转化方

45、法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 劳癣北从托竿逼沥张钞圆乞到肃傍八员饯疲抚共辰茁拐牺兜誓痉扎渔蒙彭第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 3、转化细胞

46、的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养一个小时原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作拈乞睬迈罚渝锤隅箔寓坞杏歇帝低琼屎械忻妹殴避密缔钞柿叛变郑产火毋第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4 扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定哩诧赁这捎眯伪膊滞毗戏划供弘荚翅目非平溉庚烃坝蛛烛阻艰源哮嚷拉咯第二章分子克隆 4 第二章分子克隆 4

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