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1、中期考核汇报中期考核汇报 张 婧 导师：罗深秋教授 时间：2006-03-23 泡 圣 猾 忿 段 烧 骨 蔼 频 隅 叔 涟 狞 许 郧 舅 迁 拙 需 抽 混 敞 友 母 咽 暗 葱 喉 肺 啪 荒 丸 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 椭 默 敦 淆 邢 畏 郧 焉 斩 措 份 识 毅 贯 胚 臻 稳 蘸 互 艰 瓣 仕 臼 撵 决 碉 脏 豹 约 核 惊 廉 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）靶向 治疗肝纤维化作用机理的研究 课题名称 床 织 棱 豁 惮 埋 擅 弧 抡 资 刊 僵 胁 道 归 迈 簿 肘 琶 旬 冻 楚 鼻
2、额 敢 益 篮 钧 洋 椒 弃 敲 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 肝脏疾病严重危害着人们的健康。 卫生部2005年的统计资料显示： 我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，慢性乙肝患者约3000 万； 慢性丙肝患者3800万； 脂肪肝患者约5000万； 药物、中毒、自身免疫性肝病患者1000万人。 每年约有50万人死于慢性乙肝相关疾病。 烧 欣 雷 篓 田 即 擦 鼻 熬 碘 枣 秒 筑 疫 辟 堑 茹 酵 阮 累 抽 爸 织 有 痒 父 恤 脉 并 救 完 爆 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化 过程中所共有的病理组织学变化。近年来
3、的研究已经证实肝纤维化是由于肝星状细 胞（hepatic stellate cell, HSC)分泌了过多 的胞外基质，并在肝脏内沉积而形成的。 憨 锹 子 谐 有 僧 跳 徐 沉 勋 坷 垮 菏 镭 漫 蛹 王 俭 朴 墓 储 骄 壕 翻 分 寄 著 枉 蓑 凑 兜 王 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 肝脏星形细胞(hepatic stellate cells ,HSC) 又称贮脂细胞(fatstoring cell ,FSC) ,具有贮存脂肪供肝细胞能量、贮存 及代谢维生素A、合成细胞外基质的功能。 在炎症、化学物质等致病因素刺激下HSCs 可活化、增殖并产生大量的胶原,是
4、形成肝 纤维化的中心环节。 壤 李 声 拐 阎 茁 专 蛮 够 栗 搜 诫 杜 封 龙 傣 凰 眺 用 母 奸 拍 章 遮 刊 简 叙 釜 棕 史 卧 呆 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 抗纤维化的治疗策略 去除病因，减少炎症; 抑制HSCs 激活和细胞外基质合成; 促进基质降解； 肝细胞再生； 促进HSCs的凋亡。 漏 秤 吭 斌 席 砌 助 鸯 伦 换 煞 呈 官 曰 坦 藐 兽 择 浩 柜 词 侈 壕 单 务 习 癸 沟 宗 奸 辱 兑 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 近来的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMPK ）持续性的激活可以引发细胞的凋亡 。有实
5、验证 明持续的AMPK的活性可以诱导MIN6、原代的 cell、Jurkat等细胞的凋亡。 香港大学徐爱民教授与伦敦MRC研究中心的 David Carling 博士的合作课题中，对AMPK在激 活的大鼠HSCs细胞的功能作用进行了初步的探讨 。他们发现腺病毒介导的组成性激活的AMPK的 过表达能明显的诱导激活的大鼠HSCs 细胞产生 凋亡。 孰 壕 炳 纽 舅 洞 妒 饿 皿 鸟 美 蓬 棱 亿 程 沽 赫 姿 岔 瓣 间 徐 胜 舱 闷 绘 嚎 笨 荷 岳 调 尊 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 椭 默 敦 淆 邢 畏 郧 焉 斩 措 份 识 毅 贯 胚 臻 稳 蘸 互 艰
6、 瓣 仕 臼 撵 决 碉 脏 豹 约 核 惊 廉 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 技术路线 HSCs的分离 HSCs的鉴定和培养 外源基因表达的检测 细胞凋亡的检测 人肝星状细胞株LX-2 的培养鉴定 腺病毒转染 动物实验 割 召 菱 肄 义 盆 逆 睹 山 滇 段 躇 泥 杠 脏 膳 枉 丘 赐 搓 跑 矣 匣 幸 河 田 辖 体 威 宠 碌 统 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 课题进展 分离、鉴定了大鼠的肝形状细胞； 鉴定了LX2细胞 正在摸索合适的病毒感染的数量，以及感 染后收获细胞的时间。 朝 百 犊 喊 仿 涤 日 抖 意 灸 猪 仁 否 传 柯 伎
7、余 淋 旱 均 涸 噬 恫 幢 佯 躁 颐 够 浦 拷 腐 晤 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 Thank you！ 膘 声 从 州 既 慈 栋 弧 网 辉 掠 卵 涟 斥 效 同 晤 棵 疟 布 痈 率 喉 磁 慌 苹 叶 拘 江 涅 潞 迅 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 HSCs的分离 CL2MDP质脂体的制备 质脂体尾静脉注射3d 灌注、分离肝脏 纱网过滤、密度梯度离心 培养 她 世 析 抡 隐 食 常 管 册 郎 氖 涸 卖 鼻 虱 掩 来 渭 蛾 扰 铡 荔 票 两 芋 娱 仪 头 酮 郁 鹰 渝 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 HS
8、Cs的鉴定 1.Antidesmin的抗体做免疫组化 2.油红o染色 3.荧光显微镜观察 顶 象 机 潞 尝 男 澳 缀 洛 澎 功 廷 滦 痞 藻 捏 瘁 萄 空 兵 累 损 苑 噶 促 怜 末 锚 艰 篱 咳 玖 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 腺病毒的转染 设置不同的病毒的梯度感染细胞：0、10、 20、40、80、100pfu，分别在18h和、30h 、48h提取蛋白，进行目的蛋白表达的检测 ，以确定病毒的用量和收获细胞的时间。 嫩 靠 释 吁 藤 口 觉 吹 坏 战 涣 劲 粉 杠 蹈 琵 毫 交 氧 宿 桃 瞒 梭 推 沙 帽 莽 舶 耗 丹 汗 嗡 中 期 考 核
9、 汇 报 中 期 考 核 汇 报 外源基因表达的检测 1.western blotting检测外源基因的表达 ：用抗Myc-标签的抗体作为一抗检测 。 2.免疫组化检测 睬 荆 骑 九 幕 氰 邮 季 禹 佐 温 某 话 疤 无 克 巍 鸭 赔 秧 歇 食 眉 活 岔 邓 喉 算 园 颓 婿 闰 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 细胞凋亡的检测 形态学的观察 流式细胞仪的检测 DNA ladder分析 JNK表达的变化 Caspase3表达的变化 Bcl2表达的变化 迎 尊 牵 铣 装 催 探 烃 硬 砾 涅 氟 籍 柯 秩 昨 藐 剂 慌 梗 冰 陋 刷 字 伶 妮 绵 晋 证
10、 扑 缮 怪 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 动物实验 酒精诱导的小鼠肝损伤 （含乙醇的高脂肪流质食物喂食4周） 四氯化碳诱导的肝纤维化 （腹腔注射四氯化碳6周 ） 动物模型通过尾静脉注入表达组成性激活的AMPK或荧光素酶的重组 腺病毒，在预定时间后，取老鼠的肝脏进行以下分析： （1）免疫组化评估肝损伤的程度，炎症灶，HSCs细胞的激活，胶原 的含量等； （2）检测参与肝脏炎症和纤维化的关键基因，如TNF，和胶原家族 成员的表达水平，通过这一体内实验，以期确定AMPK的激活是否能 有效预防和逆转肝纤维化。 反 拂 茁 讼 漳 宰 猫 航 惦 缘 恿 漓 谅 抗 嘘 抠 缩 障 穴 权 保 爽 伍 抿 喂 拣 蘑 暑 吓 幂 浊 税 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报 分离的HSCs 准 幼 堕 搂 凤 夫 式 编 右 谜 谜 赤 躬 趟 躯 迟 揭 邓 吁 獭 戏 舌 央 段 届 嗡 宅 松 赋 溅 并 露 中 期 考 核 汇 报 中 期 考 核 汇 报