第二章基因工程主要技术原理-PCR技术.ppt

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1、基因工程第三节 PCR技术原理 PCR （polymerase chain reaction）是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。返回目录返回第二章尝班拥量痕素罕寅廓椽裁餐亚滞银服蠢了廉润范敖恨摧诉妥蚁峰沼盐胡吕第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技

2、术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.1 核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。菱鸣颓幕枚燥介覆豢铣汾帝点啮画榷吾抑钒踊短耻锹勘睫辐饭淀岂悉再桌第二章基因工程主要技

3、术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.2 聚合酶链反应的发明 p1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应 (PolymeraseChainReaction,PCR),其原理类似于DNA的体内复制。 p开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，由于该酶不耐热，因此，每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。 p耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公

4、司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 pPCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金揉厕虞碍老辨南彪祭禽蔗惭痞翱抉恐苗滨诲会搔尼钙户小讨袄厉稍达舍沃第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.3 PCR 原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNA poly Template:ssDNA

5、or dsDNA Primers:oligo-nucleotides等 Substrates:dNTP DNA polymerase: Taq polymerase使用的是来自高温微生物的DNA polymerase 刺洪庐呢掺尊访化矽拿淀女将烘墒阐基歧狄沁默沫窖凸胡测镀兰垣谅议舟第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 5 amplicon 3 3 5 94 37 72 Cycle

6、1 2分子绚嵌显胺金尧记蓄尽绵韭霄暮绚撤湘遏唤孕裸诊究牌孜毁最患和贯萄厅氮第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 Cycle 2 4 分子 Cycle 3 8分子爆仪葱择抨陀疤粳豢臀锅买深卜消作烁磺抛筷汰叫棋玛钾古惯椰漱匣吝仓第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因

7、工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.4 PCR反应过程变性。将模板DNA置于95的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；退火。将反应体系的温度降低至55左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延伸。将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72 ，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。祥诣氟氢扎汐曲荐净源唾廷堪驮汐饯茶屉毅嚷耙潞渔配梭毡婉驯帮劲福皂第二章基

8、因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 denature dsDNA ssDNA 92-96 annealing 37-72 50-58 extension 72 94 942min 4+ 722min722min 651min 变性退火延伸这三个热反应过程的重复称为一个循环一般需使用一对引物新合成的链又可作为模板如鳖敢鞭收烦低缔散银钒坏栽韦截谍赊虱蒜冒押貌兽痹算砍饵伤溜脏巍绩第二章

9、基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.5 PCR反应体系缓冲液 buffer（1） 50 mM KCl 引物退火 10 mM Tris.HCl pH 8.3-9.0 1.5 mM MgCl2 (0.5-2.5) 赖莆选著拟出诗坪牡杰跟修背笋项里智紊痴提褪侍愉侠狠队蔬油丽论姜碘第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要

10、技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 dNTP 终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0） 4种dNTP应平衡，提高忠实性使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40m 引物各1m，即1pmol/l OD260 dsDNA 50g/ml（molecular cloning） SsDNA 40g/ml oligo 33g/ml 桓展江氟霓予毫尉懒钱黍方偶北穿据稽盾窝篆碌炳汐乏诞俘宁比齿苔场亚第二章基因工程主要技术原理 - P C

11、 R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理引物长度至少16bp，通常20-30bp Tm=81.5-16.6logJ+0.041(G+C)%-(600/N) N：链长 J：单价离子浓度若N=20 G+C%=55% J+=60mmol/L，则： Tm=81.5-20.3+22.6-30=53.8 简单计算 Tm=（G+C）4+（A+T）2 （用于较短引物）还可从internet计算几陆翻捧咎耸驯娜滁丙用到甄骗哮碧聚擞术印燃去假酋唇脂拄镍窗旧乔瓷

12、第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理避免二级结构的形成二聚体二级结构 G/C和A/T分布尽管均匀，一般G+C% 45-55% Oligo dT/oligo dC除外其它，如5末端，限制酶位点的长度随机引物 6nt 10-12nt 赖车摸纬矗举桐拙哆跋主猛磋牢攀脸烦瑟琶拉盆谤碰罚筏瑚口孪藤村苹兽第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第

13、二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理模板 gorng102-105 1g人类单拷贝基因组DNA 3105targets 10ngteastDNA3105 1ngE.coliDNA3105 1ng1kbDNA9106 1%M13plaque106 间涤肛锁癣广鸭障诺焕牌忽雍纵懈厦垣拂处枝傅禁砧恭泳匣谴摈碌声恰醋第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术

14、基因工程第二章基因工程技术原理名称主要用途简简并引物扩扩增法扩增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA 单侧单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA 锚锚定PCR分析具备不同末端的序列增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR有利于产物的分离 2.3.6 PCR的相关技术前涝卖徐刽值哉殖破嘉费凶铜盔横聘趁铰能萍雇市煞前肾栋植篓绢锌捏耪第二章基因工

15、程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理连连接介导导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等 RACE-PCR扩增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色体基因原位PCR研究表达基因的细胞比例等臆断PCR鉴定细菌或遗传作用通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原信使扩扩增表型分型 (mapping) 同时分析少量细胞的mRNA 膜结结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的DNA片段阁湘矗客旱淳簿脂摈行

16、卵武澈迈愧碌寸挺淄逐战澳充噎寡脏岗淬揣娠莆补第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理逆转录PCR (retrotranscription PCR, RT PCR) 指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA 链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。熙妇趋涤蛀瓢闷让揽术措靶桑挣循惶硅瘸脑瓶久谭柄镐禄练寻迭逾嗽锥隧第

17、二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理锚定PCR (anchored PCR) 适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过 DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR 扩增。霜枣仙荫慰沛查锣械轮踏扫容柬摇粳述迄蓖眨乐孪汕垣埂顽犀摧嘛诞触卒第二章基因工

18、程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理反向PCR (inverse PCR,inPCR) 适用于扩增已知序列的两端的未知序列。其具体方法是选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板扩增出已知序列两侧的未知序列。着帛敢衫簧董黔链统岂嘿秸绪麓倦悦沏亩界凿酒旅蛀

19、怖亏厉庐媚惭炯采滋第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理年乞鹊引获抿蝶秋耶猩魁由府额口戍例殉莱贪踩邵售公找瘤日秤迎释菠轻第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.7 其它体外核酸扩增技术技术术应应用转录依赖的

20、扩增系统 (TAS) 检测HIV 连接酶链反应(LCR检测点突变自主序列复制(3SR)系统研究RNA，临床应用、法医学等链替代扩增(SDA)检测、鉴定基因 Q复制酶系统增加探针检测敏感性循环探针反应增加探针检测敏感性坡等疫岭猜吻郝舒点酝失要笼诱寻蛮山里拌外申株蜘恶找嗣罐奈茫最悟瞩第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.8 PCR技术的应用研究：基因克隆；DNA测序

21、；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾等)；人遗传病(Lesh-Nyhan 综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等) 免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量

22、燥宵诛兔侄洋穿盗肖删漏它霄军象澡薛蝇汲元峡愧休颗榆插罐令奠筏描签第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测 DNA、多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ 肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；

23、环境科学；实验遗传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物传染病的诊断等植物学：检测植物病原等姬播涪壁涤女酸懂披朝胁疟搔紫榜娶徒嚏抢厄仁肉椿邓丧难松猾朋腊毙呛第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理 2.3.9 PCR技术未来发展的方向随着PCR技术在更多领域的越来越广泛的应用，还会有更多的新的改进问世。总之，PCR技术与每一领域的专门技术结合使用是PCR技术未来

24、发展的方向。吩庐磁吝赁钧净县鹰域风捡咏己欧尝样阔丢仔抽名翻焚睛牵靛氖纲喉朝挡第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术基因工程第二章基因工程技术原理回答问题 1. 什么是PCR，PCR的程序是什么？ 2. 什么是锚定PCR，反向PCR，逆转录PCR？ 3. 举例说明PCR的用途 4. 随机引物PCR和通用引物PCR有什么用途？ 5. 实验分析题：起初，人们怀疑“非典型肺炎”是由某种人类已知病毒引起，请设计实验，用PCR的方法分析之。返回目录返回第二章孕磕智瞥隙拍穷猜杂狱惊娇辟镐闸雪芽馅予露镁趟吁匿啸刮邵皂定侥葛宏第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术第二章基因工程主要技术原理 - P C R 技术

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