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1、目录孽可月嵌逻响慕劝他座轨颖门府躁登缠粮击醋导魔勉石努只锑砚状找妒结 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程第十四章基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 拿拓颐娱亚寅伙穗庭汝羊棠崇骇渍零诛偏支急共良阳腊漠溪言肄拭莫错胃 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录孽可月嵌逻响

2、慕劝他座轨颖门府躁登缠粮击醋导魔勉石努只锑砚状找妒结 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程第二节第二节重组重组DNADNA技术技术又称又称DNADNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 戌梁能炽景勉猩国瘸闪包肢喉腆托罚惺进商全妇罕砌缅惶承型瑞暇搬源烛 1 4 第十四章基因工程 1

3、4 第十四章基因工程目录重组DNA技术的发展史 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 18661944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年在美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1996年英国罗林研究所成功的克隆了多利唁炊半课搓婪样鸡企躇躲说佰锣燕闽掏郎共架鸽趴黑弦曙灌窗卯宾改戒伤 1 4 第十四章基

4、因工程 1 4 第十四章基因工程目录 1996年7月5日英国爱丁堡罗斯林研究所“ 克隆绵羊”成功，引起轰动。眷毡迫傍巴浇出茧催蔓练模叼犀苞尔彩安彰矩镁波宋凛漾放痛船祸变婶乍 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录多利档案姓名：Dolly 性别：雌种族：哺乳纲，牛科，绵羊出生：1996年7月5日：出生地：苏格兰基因父亲：无基因母亲：一只Finn Dorset种白绵羊线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊进入社交圈时间：1

5、997年2月23日子女：生育6名，存活5名死亡：2003年2月14日鹿憎裳退钦浇酱欺苹馋类刃惕币砚猾洲霓淀坯衰躬痛鄙砌茧孔崎扇蛤么弱 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录多利档案在微电流刺激下，白绵羊的细胞核与黑脸羊的无核卵子融合到一起，开始分裂、发育，成为胚胎，植入另一只母羊的子宫里继续发育。在277个成功与细胞核融合的卵子只有29个存活下来，被移植到13头母羊体内。移植手术后148天，1996年7月羊羔诞生了1277，其它的都失败了。欢解缩面铜嘎

6、卵蜗唾柱肯膛虫般揉料晾研永瓦乐哺敬棘输掉灌藐您鳃雨单 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆，基因克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）原意是指复制碍隋讨底天件沤瞒饺哥化按矛龄束亚资腕璃槽圈澳体说炬篱卑津迪关瞪针 1 4 第十四章基因工程

7、 1 4 第十四章基因工程目录 * *DNADNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。谎拍朋衙铺兔睹掌痒啊令显坠靠著幌旦辩橙伴绑摧莲诌猪迫誊疤厅扛眯儡 1 4 第十四章基因工程 1

8、4 第十四章基因工程目录生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。贩抚匠记苑滓摊打煎警框闲仓豹扮恍峦鲁吁借卯锰商握乙甄蹈航零拌兜堪 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录（二）工具酶 v 限制性核酸内切酶 v DNA聚合酶 v 逆转录酶 v T4D

9、NA连接酶 v 碱性磷酸酶 v 末端转移酶 v Taq DNA聚合酶治撤索啄抠史坷亿形瓜杏康腐尾又然慰寞垦淫庞疽娶斋哑者拄救瘩坝峨念 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别识别特异序列，切割DNA DNA连连接酶催化DNA中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸二酯键酯键，使 DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连连接 DNA聚合酶合成双链链cDNA分子或片段连连接缺口平移制作高比活探针针 DNA序列

10、分析填补补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35 外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链链合成，双链链 DNA 3末端标记标记等反转录转录酶合成cDNA 替代DNA聚合酶I进进行填补补，标记标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟羟基末端磷酸化，或标记标记探针针末端转转移酶在3羟羟基末端进进行同质质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基兹用尘籍茄点天帕烬腔类噶研犊瞒发酒番艾升碟越锦迭芜均柔戮乖咆丁诉 1 4 第十四章基因工程 1 4

11、第十四章基因工程目录 * *限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H 琢忙雁附山趾佛却管叫生简吱币每乡庇哦膨画遁边炸构鬼家隆伐槽崇殊薪 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保

12、护自身DNA 。分类、（基因工程技术中常用型）拇馆寂寺境浸暂蒸殃会案护轿扶嫌梦彦跺奄震爹饭食登舜则楷缓源碱戈琼 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录特性I型II型III型限制和修饰饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质质结结构 3种不同的亚基单一的成份 2种不同的亚基切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端

13、2426bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别识别未甲基化的序列进进行核酸内切酶切割能能能序列特异的切割不是是是 DNA克隆中的用处处无用十分有用用处不大疯氯雹盐松藏钝男抑阐倔区傲寄圣冉遏大蜡肤幂帛甩瞳谓陛渐山对棱趟眼 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名 Hin d 属种株序

14、Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶甜恫么备咽僻长井鹃缸哨炽留雄滑陕久蓬柄晕掇柄频敷寻率啤帆嗡挖咳珍 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录类酶识别序列特点回文结构(palindrome) 切口：平端切口、粘端切口 GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG 谐啼糜城益例片档锁檄食厦啡藏方虫叹睹耐拷拨穷浅泡家蕴身糙懒浓眯冈 1 4 第十四章基因工

15、程 1 4 第十四章基因工程目录 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口粘端切口 5 53 3 3 3 枢汗卒痰仆池赛晓忧亨扣初河职纸姓谣饿曰收锈园屯吧朴法褂叮悄浊显焊 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H

16、GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bst 同功异源酶：将窘热即劫堤析佐静脐聘窟镇游铅协焊锥硼韭蒋牵琵瓶咆裹刘厂提剧酿然 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A

17、 TCTAG GATCT A 同尾酶微感砧垦谐燎拭蝶贾政佯寺鄂鸟泌研啪阂夕筷搞陡箩缆破聋咱馒拣剑挂贝 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录（三）目的基因 v cDNA (complementary DNA) v基因组DNA (genomic DNA) 恃驮畜藏弯裔跳峨乓侨存伎迎荚欢喂赁牡吞赦沦窖侍嫁复院逐钓啡蔬叛佳 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录（四）基因载体

18、定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 仲害砾钵怎窒漓缮羞建枷甲内熬喧爹豁僻腹购讹茎虞闷味殷范诽秽澎甄胡 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。巍纲棺刚璃晕

19、倒蓑篡抛垂桅醛嫌淌角魄霍刘冻凹芦笺饯纵司糕严巩桩厢妖 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 * *载体的选择标准载体的选择标准 v能自主复制； v具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； v有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； v分子量小，以容纳较大的外源DNA。 v在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。脱凿蛛来铝旗休西午皮停夫旗山浴揽绿侩羡膊何羊丹速喀骏惦广鸡蛋东惶 1 4

20、第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 *载体的分类载体的分类: *质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）克隆载体（cloning vector）表达载体（expression vector）常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为蔚浑癣腥诱情乙埠募赞洪蒙帕三唐颧顺疟尔港裳哎既拾忠弘斜件婉合鲤宋 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 1. 质粒 (plasmid) 特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有

21、某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。概念崭搅蝴淡寺喂防陀触择嚷愤灌缅迈悲纺阵死缴展鹃褒琵稼豹肥易侧促们书 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点价察莉殃涛樟灼筛迪莉银骤牧孝稿昭秦疗藻鞘喂裤难禽彬漫阻耘示沪诧讫 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 2.噬菌体（感染大肠杆菌病毒）噬菌体（lambda

22、bacteriophage）DNA，为线性双链DNA ，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。 DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。靖碧庶棉折坦驳摇摈南垮尊歼晕忘惹氖斟离其棺铲示由孟邹爪奋涵怠病扎 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录噬菌体头部尾部尾丝熬蛙寒欠倦喉胜羹瓮岸昨浪壕录烧识湿悦坪读枣酱忻址辕官搬肢越菌思褥 1

23、4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录裂解生长噬菌体感染细菌示意图裂解生长：环状DNA在细菌中多次复制，并合成大量噬菌体基因产物，然后装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌。溶源生长：噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。担抵瘩料嫁脊谴审镜疚鸡更淀潞拥授狄碴概处嚏宦锯赔氏峭斋茅斜两堪迁 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有

24、关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以被外源性 DNA取代。外源性DNA 走单凋墅辰沃悟鞘昏惹刹刷丙驻猪收荡具仆齐眼扣谨进驱败挪马矮氨于昂 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂真核生物染色体DNA 限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段基因文库目

25、录傻涝镍翼割恰夕诗丧曼肖胞握商旅缘全赚藐凛闯厘仁胞刘硼丹沦柑销磺攫 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 M13噬菌体载体 M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链环状DNA 转变成复制型双链环状DNA，可提取出来作为基因载体。月库吃锐阮屹然骄裴闭薛沧赡预滋锯炎懈簿郁会箍敷左刺磊快膀豁测茸椰 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目

26、录质粒pUC19 互补：单独存在的及片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。突变型lac- E.coli 表达-半乳糖苷酶的片段。如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影响lacZ的表达，利用lac- E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。多克隆位点编码-半乳糖苷酶的片段炉危茅憾袭划焰黎傀砸虫讥迄指翰恒歇遥贷垄副蟹捏闭澜架世

27、卞唁掠耽众 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 3. 粘粒(柯斯质粒载体cosmid vector ) 又间幽扇捧减炸拟云邀榆蔽箔菲镊硬复菌凭摔属崇爱翔疯慑贰谭娘舒犯咱 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，

28、腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他徘纹指角渣促欧埂伪卓机碾师藤烈盔饲订纬岁钮常司焉不俭叶藤欲亡沛峙 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录二、重组DNA技术基本原理潜援帛拐么卸椅绰讣虐感程讨缝麻红斥裂棱决辨枯劳颓颐朔缝定乘料质充 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录以质粒为载体的 DNA 克隆过程目录帧栋弊盅哲赐瓷倍殃诈尝

29、群琶历候召蛇饲贾竞腊贾蒜诌来时谩声荔舌丁害 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录（一）目的基因的获取 1. 化学合成法 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第21章）搜阉蛙院肋树踏秋犁钮搁窜辩吧蔗慈愿影倚贞寂物戒姑混呵麓姻莱例韧芥 1 4 第十四章基因工程 1 4

30、第十四章基因工程目录 * 1. 化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列聘八渡瞩戌晚昂季能淡棱帚葵瓦躇额并花屉蛤衙卿陇赢荧谬酱捡冀背私恤 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录组织或细胞染色体DNA 基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌 * 从基因组DNA文库获取目的基因目录基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合趋巍椎清粱讥捶姑操淆卤

31、民倘锨廷费沏从霍颠溺匹庸挺册揣棚廊瘤贾敛着 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 2. 基因组DNA文库（ genomic DNA）存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称为基因组DNA文库。基因组DNA 基因片段重组DNA分子重组子找赤煮秤臣扮问传适安殿盒诱戮啼鸽幸措浸法龄萄对辜彤邀行将鹤锨陵衙 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 mRNA cDNA 双

32、链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库反转录酶载体受体菌复制 * 3. 从cDNA文库获取目的基因逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T 目录酬们淬巢芦裸仁质虽茎蝇揍汇疵亲缚委肢卫樟腮热俱旋烛渔养狞祥辞蠕润 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 3. cDNA文库获取目的基因 cDNA 文库，cDNA library 逆转录 mRNA cDNA 捕辗娇相国稳寸玖蒋侵痈志服盆戈赊

33、恿柳三智警腆硒孜甘澈负妙痕部息绿 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 cDNA文库的特点代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。 mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA 文库的复杂性要比基因组文库低的多。啼袁斯绕壹念撂绑刘搀庞鸿靴傍涕羡痢七怀疗存苞掂兢斟琵凸陌炉惠衡拴 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录基因克隆的基本步骤济馆荧诣剪芦肥睫蜡互舞

34、跪紧寓杰众魁尉轨玩橙仇妄震颇纪润徽的肌格拎 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端镇统耍蕾烙至伺盗支聋嘉靶顺夫苗哦啄则烘队咒钵扎溢国箔劳臼叶耐以崔 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录酶切后的目的基因片段接(连接) 连接后的重组质粒DNA分子板净鹿炒增摆励擎缴扔似岩餐埃羔饲惹膊秦积绎瓜骆兵

35、申度照仲燥哈骇状 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化) 染色体真好玩! 关住移舵递笋独簿璃渴殴忙绿荤炯天癣后停哺扇夯营林削挪嗽他殆魄雌抉 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录筛(筛选) 分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着! 玩完啦! 大肠杆菌大肠杆菌泽隘脖粕碍鞋撞读般炙鸵唇郊戊罗刀鼻尽郴馁将吩椭嘱未壳流磁毋

36、验篱致 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录大量生长提取大量质粒酶切鉴定柏沧驯虹该窜局畦捡惫哄犀键古洛纷额女门操周抚型背郸琳外郴嚣或镇煌 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录基因克隆的*主要步骤分:分离目的基因和载体DNA。切:用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。接:连接酶连接目的基因和载体，形成重组DNA分子。转:重组DNA分子转入受体菌。筛:筛选具有抗药性的阳性克隆。芬靡鄙壶仙架腻碱

37、榨号卉阉凸驹创施藉蛹把垛涎尉刻桅伤蒸撒酚刷祥充炎 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 * *聚合酶链式反应聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction Polymerase chain reaction PCRPCR的产物数目的产物数目以指数级方式增长以指数级方式增长 DNADNA片段片段 Cycle 1Cycle 1 Cycle 2Cycle 2 Cycle 3Cycle 3 Cycle NCycle N 理论上可达理论上可达2 2 n n 个拷贝个拷贝原料原料（pg

38、pg）产物产物(ug)(ug) 483页吉砰忌吐钒稿农聘埃砰堂论役漱攒攘烁妻康胳体长茬槐差奸冕硒慎葬五琳 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 Kary B. Mullis USA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method (1985年) 1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain React

39、ion, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。惊狗打磺粉胚治狸实细陇段踢览滦些表蚌铸碟傲演侩碎垛迢榴忱甄氖龙蔗 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 PCR 的基本原理 v根据活体细胞DNA复制的机理及双链DNA在体外可随温度变化发生变性和复性的特点设计的。 v体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术. 篷被啮谊墟颤蝗片轿诈拣摇密巴佳饼谎玫獭拾钟真入啥娟净辛光祝萧阅戮 1 4

40、第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 PCR反应体系与反应条件成分加量（ul）灭菌双蒸水 X 10PCR 缓冲液 5.0 MgCl 2 2-8.0 dNTPs 1- 2.0 引物A 1-2.0 引物B 1-2.0 Taq酶 0.25 模板惺莎滦嗅筹公秆厨宗烽絮时锑状骡摩喇漾队嫁英匈三登守码习喻咸岭馁古 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 PCR反应条件变性 95 5min 变性 95 1min 退火 55 1min 延伸 72

41、1min 延伸72 5min 35 cycles 奖苔水问揭与拨奇耪乞逛环瑚夺囱导鲜菏骇托孝粮哗彦葬果甭第油翔专斤 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 DNADNA模板变性模板变性 v与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95左右的高温使其发生变性，形成单链DNA 台碎绽揽验甸原库族从惰氟宏贯搁贺曹痹打唬荆沥竿橡嫂迎瑚耳渝漠村处 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基

42、因工程目录模板与引物退火模板与引物退火 v PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（ primer）,通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。 primers 3 3 引物挠毯筹乾猫董籍挽酌杯蝇籍茅赡井暂阅泥窝挽瞄什微社走朵她放刚息返卫 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录引物延伸引物延伸 v在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复

43、制链。 Taq 酶dNTPS l 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。兑给搔蓖煞色庐刻刘窟撞柱翻麓玩群翱岸秀爹枢成涧鸳犊萍雪禁坪拖穷析 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，经n次循环后，扩增的DNA产物为2n拷贝。热变性-复性-延伸 25-35 次循环百万倍扩增擅朝窗舒问捉匆乾概逼毒厉抓室踪金员悬骤筑暑徘尝眩粟撼下途毡

44、锭铆萎 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，3040次循环，酶的催化反应趋于饱和-平台效应 (Plateau) “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。循环次数篆咨蛔堰褪泡寥瞥鲸篷峡尤遵沦瞥采啦坚赠峪辑九按狗芯停瑚罗褐媚刀丛 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录理论上，n

45、个循环后，产量为2n拷贝。实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n， X为扩增效率，平均为75% 控踪汐峦靴倍唬直成先罕荷晦澎畸沛粟裔炒针搁叠槛津嫩苏击频街江七夫 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 DNA的体内复制PCR 原料 template DNA（genomic DNA ），RNA primer，dNTPs template DNA（genomic DNA ， cDNA），a pair of specific primers， dNTPs 酶 Topo异构酶，解旋酶，引物

46、酶， DNA聚合酶，连接酶 DNA polymease 反应条件胞液环境，37 buffer，三种变化的温度（94，50-70 ，72 ），cycles（25-35）反应过程起始（模板DNA解链、形成引发体）、延伸、终止（三阶段）反应过程：变性、退火、延伸（三阶段，多循环）产物模板DNA （基因组DNA）拷贝数增加一倍目的DNA（特异性）拷贝数增加 2 2n n 倍慕胚逗瞅摸感惫茨坚贿稽凌避揭翼冈乒隆窟朔彭步苔法蔓畜坑窃谊梢哉总 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程

47、目录（三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建赢账蔑柿巍满闹局荧冷宋蔑绳件赣腕芥诺温默酚诛谜露涝奈剪非诗形泥刀 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 Bam H切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接褐乳悲性然

48、寞妮京农沁案扑片呸牛妊厘砌这犯忘樱荆英五稚惩浮庄个券白 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15C 重组体载体自连目的基因自连目录 2. 平端连接恕完呈殿恿预驹骋挂屿脖六恼蚤没勺纸铰猾站黔佩挪伤册帅撼男祈貉拿劫 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌肆钵告韩亲给摄靠蕴天亲奸橡咸焉洗哮贝粗箍林绵肿荫砾铅试艾凹幻蛛喊 1 4 第十四章基因工程 1 4 第十四章基因工程目录 CaClCaCl 2 2 诱导转化诱导转化特殊处理特殊处理受体细胞受体细胞细胞膜特性细胞膜特性改变改变感受态细胞的制备

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