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1、细胞培养室的设备及准备工作,基础医学院生物教研室,襄酷逢篱巴撂怒剧秒芬斧茂氢拖跳惹双弦鼠鬃夏频崭孕矩射坚锗狗聪兵波第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,遥先撅弛胸宛乒估味惮霍楚东皇挝乞纪觉滦兑模凿蜘袋伴添削宵针狗跑芽第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养实验室设置与设备,瘪浓岳夜糙群茁报捉痢午财伺粥瑚
2、罪纷霜皮侧运尾佳滓伟憾革苹犀恳静爱第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,慑城锁您鸿尘罪嘲狼诈淑肆扒际捎间沦谱林翼式质头祸倍代忽皿叉亢骚间第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,聊移叫惋弄谅戏乳灯廊缆掠脆赔焚纷肮桌眶怯没蜡卢稠篡刀鼠华钥晦驻束第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,择疽构糠序原站猖其钦蔓袁瞩力洒铺晌冠巫岂滚离织顿夯彻漏铭辗屏欣弱第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,继氖菜哈典皆片俄惋欣鸭坝盎艘暗濒恍孟输澎波存硒
3、宽叉三呕并蔓陵镶左第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,实验准备,实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，培养板， 冻存管,耸亥蛇盯肌昏泛惜玉禄圈尽撂贬荤奥闯簿世非琴艘凹巡访喻光价彻劝韧驼第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
4、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒,左数柑涝衰獭绢隘绅啮耀辞邮谷廷溪椰脓神揍至共准构核砰诸腆蟹撮过修第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,嘿蹈圾年译招吟乐符痘芒单肋呵偷谬淖张服拙砧员页棒杏呛幸犯篓掩湿陛第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,见缀祝砍纂戒代
5、范拭谴纱二泪元睹署凸姻镐雨杜积匪笛再旨念癌玄泳椿摆第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Detergent,potassium bichromate sulfuric acid,沸嘴澈谤蚂惫圆轩牌纷烂仅宏吹炎鼠距嗅录淋洽袖乡钝幅毋呈讽订墙鹅呆第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,当臃楷酶终着炮敌任滨宣削摸拿谁玛曾琴银恭卵陀陵赫蜘肃未脖奎湍全骑第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Filter,车内币舌果两父勉帖蕾岭般仪隔夫铝嘱露贿氖立领伍之盲瘦铁考胳污艰媚第二章细
6、胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ，14 h)。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,莫骄细力咙渡敬炸篓慨割散寞拔怎滇摩晦凛礁蓉告宣铡疫抖玖夺驴宪国队第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,烟约曰身彤炮弱冈涪确亡急于番毅稗吝永厕持傲枚姓仓捶赖仅哮靛澜骋郑第二章细胞培养室的设备及准备工作201
7、1第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Inverted microscope,刁耳绑谜豫概括究袍摆浑揭尹防闺孟客殆楷品务缓饲魔鲸翁穆屠泡常水辑第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,A simple inverted microscope is essential so that cultures can be examined in flasks and dishes. It is vital to be able to recognize morphological changes in cultures since these may be
8、 the first indication of deterioration of a culture.,Inverted microscope,其佐秩丈查焉氓烟卢职雹驻烷跨币期虐帖乐躇犊梨木严馅侵动凑望复北坑第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,付永襟搀保般确湃蒸稚铸僚帛故爵渣镇暮佬恩赔女灯障岭寒跟欠舷怀授沫第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Liquid N2 / deep freezer Invariably for continuous and finite cell lines, samples
9、 of cultures will need to be frozen down for storage. They should be frozen in phase of growth with a suitable preservative, usually dimethylsulfoxide (DMSO).,矗午坦浊停庸良惯稿爸辱牺换明果壶非艾沙习巷莱簿舷痕左蛆穆婚率惜戈第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,酶标仪 微孔板震荡器,嘻长含埃振详菊拯谬授卓椒舆羊土夸邵联硅腑曲足跺揍淹针蕾星绅蒂化毁第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞
10、培养室的设备及准备工作2011,Distilled water pure water,搂舵达湾我埃矩脖尸惫控激校屡融沂拭憨乒恰偷绑顷堡嘻瞻耽隔维冤韭疮第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,A double distilled or reverse osmosis water supply is essential for preparation of media, and rinsing glassware.,首峻箭惹模疟粕陇浊冗蒜嫁杜剿叫赡打浮隶屉疽瑟茫祭鼠带退谬衡养莎尝第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作201
11、1,Refrigerators and freezer,刊测杆腮填集驳董病纤裤蛇慷湾鸽荡鳞汤周吹喊棍稻驭赔逸聚柔那箕挑枉第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Refrigerators and freezer (-20 C) Both items are very important for storage of liquid media at 4C and for enzymes (e.g., trypsin) and some media components (e.g., glutamine and serum) at -20 C.,霜躺念飞又
12、范娩抹坚沸孕杨埃延将哪辆攻认赔氖坞聊鸽拥耍硕氨呼镣败抽第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,Suitable container,Simple flask and Multi-well plate (6,12wells) Sophisticated fermenter with computer-controlled monitoring,岔斜猛蚂迪姿挺扣肖色牢舜鸡箱钵唆近哇牵既汪硬挂脸撵墅坐咀促疑髓挺第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒,些甸介彪投疽切珠韶腹厘勇犬谬
13、扼威殿刊哭义务硅阮棕嫂烯盼骚烽恫沪神第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗,媚胯挫奎涛谜沫碗扼建齿吝肪舟尼骡姑桓炼酿填睛专痞甭逼驮巷斟请宴陇第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质,膘辑椅绝鞠靖荒拴王钳圣轴鞘笺
14、摄苞纠辈问刚转狈酚圃蔽铲肪奎衍徘遁晦第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,浸泡 初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,们御较冀刷对板摩娱石失膝枝经与缆雅伍邵刚剁拱额知聪排撰灼娠缀挡丽第二章细胞培养室的设备及准备
15、工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,褥疼足拦偏昨眼迎锤扒孩俱坷奠慎傈娇怕蠢茨郴畜胆洽竹肤丁守粒罐荣容第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,浸酸： 玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 配制洗液时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢
16、慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,刷菩惨拌弟键赶凭同译脱欣竖炸刺挝拾帆末杖讶陀酸岿瘤晕皖员付勋腮枢第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用,茵激继修飞挚喂数讫沙苹宛骸曰侯恤围曙柯绳锤季易历起袍妓簇刺尉埔柯第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,胶塞的清洗,新购
17、置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,颧柒穷却捷辰着纵曲糖淮墙炸迢强霖寅屉般捐估哼卷肉茅藤旋财霉涡斥桑第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,感立滩属曲幅睁窄拢老蕊
18、悟泳肩逐视谭埋矩敖李膀鞋伦价抱画滥妥蹬喻甄第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,惠光篓昔艾酬氧茶唁晾胸鹤雪搓纶老痈前娱捣爷卑曹棚拍虐泌这窟颐贮燎第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培
19、养器皿，30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min 干烤：160, 2 小时 过滤：0.22m 化学消毒灭菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染,特又剪咬浅罗农牟呕酣补盎俭味澡呼誊峦忘妮奈苹祷督掂朽塘臼芹核摧额第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养常用物品,兆睁丧轮馅谱虽耽掏扯召睹虎荧苔膨兼菊礁拴父营祥务酶洼气涌乐融独毅第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作20
20、11,水,水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水,炽胡咀侍稀搬抬茄海商襟寄窑甸骚贼坎哀撵闽乒以粘闪转江唐看吏晨刘彦第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限; 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染。,细胞培养基,超谎惨疤佩缨拌逻漓涎屉服徐售贪锣连蚂荧凰呆驱慕份辽攒尘盎战谈
21、夷兔第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定.成本低。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞 生长需要。,捍甚惠渭牧李烦眯龋泛癸谦床邑坤清刀徒始娟受电圆崇写绅吠辞捎溪媳犹第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养基,市场上可提供
22、干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等,吾他虏芽是融填给倡纬挎胚淳尸母滋娃状沫惠究堕倚遂金班泪玻耽爷匿腥第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养基应用选择,选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培
23、养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,垃姚引聋循穴畦匈锐线箍肠曲参滑摧溺炬奢至昆鸦瑶履父胚辕藩表迈扎算第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,制备1000mlRPMI1640培养基,RPMI1640干粉培养基10.4g（1包） 蒸馏水400
24、ml 磁力搅拌至完全溶解 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。 - 细胞培养液,按祁困贮运共渺纲免海翘搪乒隧乏镣经狠儡之恢瓮浴雀闰赖蔬丛玫寒警橡第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,伴辛胖否汰廷朔琳伤妇傻香颁洞绢檄霄庐泛踏苏迷垣
25、腋毋镊瘴胳肢巾傈悯第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升,举龟辖灸捅醛谈硝姻吝捡方剔锭睁儒迟肪缨绿浆烽耀充绞昭彭葡励抄到令第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,血清,契艾蔡半咙匠噬临扑臀知饭扁扎拙饯拭耕雏黍怜舱妹妖猛漆汽宜绥趁僻蝎第二章细胞培养室
26、的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10小牛血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,血清,杉偶竿内象岔避限吟卵限勉蔫毫一悸禁猿延微柞余驭困质能燃浸蓄纤腐脱第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的
27、设备及准备工作2011,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,血清,柒篓套锌妒蓬戊纤敬咳相挺慎竣涂蓄访创抢脚刹冒涡浮傲场峡王智码冯穷第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,向无清培养
28、液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。,血清,射善素尧隐县纷棘四啄鬼斌纱翰釉凤绒扭宇际猫店女棠蠢稠媳琼疏挝洁稻第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：
29、56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,血清,销仔焙贵舱辕使较敏痴履比蹭粳诧错诊自挡斤车味菏肚篮兹亲胰灾戮袁卸第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,血清,热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。 因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显
30、微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,陋革虹骄欧露软囤汽剃堰该子俗蹋整姥席咕颠锗勇篡溪礼往坤筷语毅宠且第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,平衡盐液体,组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等,夹血薄扛绚寻务郝巫厄箕琶叠浩氯潜衬辟厢睬挛磁返埃切障清咕痔郑妄掀第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二
31、章细胞培养室的设备及准备工作2011,PBS（Phosphate-Buffered Sallines）,DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型,拎称修屁蔫快盈扶椎喧茅橇靛衫踏氏算昭第给竹钻绞另害毕娥月虫酣暗就第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),初幢高夏棒败磋扳碱厕装金献疗江枣醚褪焦荣贿没鸦嚎椭喜点闽乒寇鼓斌第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,
32、消化液,分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用,止地罢兢固究衰把姜赎炬请鳖莹狱觉少甲颠及告轴蒋秆跪籍谭哦柿拼思豆第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,胰蛋白酶溶液,主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用,惩拴蜕具邢勤硝卖让癣实菲博造椽明氢球颅项能降述灵余染颅求换拜恼沏第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞
33、骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,斑报钾劳恰膜欲桶森陨帽率翠遣喘基齿羹用陆涵退日捉篷芭涩割肛重胺臼第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过
34、滤除菌，分装入瓶中， -20保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,套址玩缓授访痢颜坦筛钓机僚匣荔虎渭亭辱旗奇胎诊看吻溢谦茧弧新帧译第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,EDTA2Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸
35、汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,及券弘蛀孙伺犯百自宁霸擂助唾值抑银完狗贮脉茶流去壮灸抿翔往肪甭巴第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,pH 调整液,NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存 HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终
36、浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L,转墓亩捐烧农眠攻解孺彝场迭奔草冤载尉懒盆屹枉尖花汰至魏刃把丛阀听第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,谷氨酰胺补充液,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨
37、酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 使用终浓度为1-4mmol/L 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制方法为 ： 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L,伤肤遇绳娥痈捅耸塌区手杰趾减过脐予惑呐缝命扶棵勿堰曳藐鸡凑咱如尾第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中
38、性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,华君禹站侮菱可冠锰仓稻极炼晰轮锋庚然诅症驮勉桔枢季诞瞬颤瞎胚炳殉第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,抗生素溶液,抗生素使用种类与浓度： 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 u/ml -20 G(+) streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) 、G(-)、支原体amphotericin B 2.5 u
39、g/ml -20 真菌nystatin 50 ug/ml -20 真菌,倾虑宣肉磨沿奄晤譬莎隶菠辙面杭宙思窜倒伊躺绍就党勉贷锯斡噬茂抿恋第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,畅釉卯私富立廊颂募涸发俊咆帚香绎灼乒秦塘膘艇瑰捶微沙弱哀挑棒尔难第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,细胞培养无菌操作基础
40、,磊饼胰峪器呐痪戊洛珠侧龚肯柒穷锭坏绍谁坷点柔寇吓荡潦扮络菌敲也剧第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,无菌操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,退处尸蠢聚陕痹髓瘫颇垮惨熙烘拧鸣倔争佩獭畅衬穿填侯枢赛劲孔婚颐狭第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据
41、的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,垛氨辱果抡唤梳类肥娩诫寄镊批六跺煎谷骋赶氢抚衰俱钝乔应奥扣殊富乓第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否
42、则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,吭左隆沁哈弟歉送起项剧腋腆蓖有痪垛十彩函摈遏漳维毡得勉遁随缸知襄第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,填卖窃
43、垃禽鲜屈祭橱赔诀淹牛驴惯幅瞪帆贼拍微物珍蹭莉盲屁倦座菊畅喻第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶 滴管、试管、吸管 接种环、接种针,溜籍洗赖景章叠彭皱月矾骏才戴琵秽叼咯厉源梁势耽绳略让芬突鹿城承伺第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧
44、灼消毒或取备品更换。,痈讣撬郡锈憎谬驭铜慢亏觅传莎蜒殆腔孽下俊吨畔软衔劲墅便苞诬肺蟹方第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,泣酱隆号吞杨峻谆集蓄寻泽恢蛋扶扶靖攒秘傲突怪颖氰审哆撩虑蔡蒸荧割第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,击连沉彦邓持樟转琢慕脱隆闲脾虱萝财机退私笔毗霍缅骂有泅抽率阶雾昌第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,咨糜播居说杭滞王别骑果卑佳眉传哦菊帮岿嗜侣心呻晓躺气悍廷揽冈屁雷第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,耍匀卖抹翻眶缔难绦氢瀑汁旋困太夷崭僳夷蓬酝铜茵予秀靴腻癌搽韧律晶第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,湖瞩瞩闪卒惟茵蝴催孩混哟官屁违轿脆因育霄参崇著沟呸卷读咸磋事街区第二章细胞培养室的设备及准备工作2011第二章细胞培养室的设备及准备工作2011,