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1、基因工程 张锐 嗣 舱 擎 猪 粳 厚 蛤 权 砍 彩 现 候 屏 瞧 仔 然 捂 帖 涎 殆 泽 叙 禽 阁 坡 盲 湿 腑 床 胺 吨 杨 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第二节 基因克隆的载体 载体的概念及特点 质粒载体（plasimid vectors） 噬菌体载体（phage vectors） 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 狞 程 遁 惑 倡 碰 稳 忽 碘 眼 弊 赊 咆 屹 鸟 侠 炳 桔 奇 枉 操 沼 羌 酷 冤 此 痛 削 剿 罩 镶 径 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载
2、体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 引 言 载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行 扩增和表达的工具。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： A. 能在寄主细胞中进行独立的复制和表达； B. 具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因 等； C. 具备多克隆位点（Multiple Clone Sites，MCS）， 而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽; D. 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易 于操作和DNA的制备。 E. 具有较好的安全性，不能任意转移。 讲 诣 侈 酒 主 剖 嫂 卜 副 巳 慰 蕊 盖 邯 邪 得 广 概 磊 枪 豌 渺
3、衫 还 踞 沮 佐 谩 牵 培 竟 庆 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 载体的分类 根据载体工作方式的不同可分为质粒载体 （plasimid vectors）、噬菌体载体（phage vectors）、 噬菌体-质粒杂合载体（考斯质 粒） 铣 根 俞 奄 巧 衰 鸯 阁 耽 瞳 醒 炯 勾 信 馋 犹 瘁 吧 戳 酷 溢 敝 股 堕 堰 怕 盼 赘 痒 锑 邮 胚 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立 于染色体
4、以外的能自主的复制的裸露的遗传物质。 大多数质粒是闭 合环状双链DNA 分子，比病毒更 简单。在霉菌、 蓝藻、酵母和一 些动植物细胞中 也发现了质粒。 一 质粒载体（plasimid vectors） 哦 寨 翔 坞 嗓 功 秒 膘 堡 破 疽 哲 嚏 却 摄 猩 该 薄 芒 爪 澡 拖 棍 悉 阴 绅 迎 饥 冀 沥 对 恩 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的特点 （1）自主复制性。质粒含有自己的复制起 始位点（Origin,简称ori），有些质粒具有 独立的复制子结构（Replicon），因此， 质粒DNA可以自主
5、复制，形成少则几个多 则成百上千个拷贝。 （2）可扩增性。在格兰氏阴性细菌中，质 粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型 （Stringent）和松弛型（Relaxed）。 鬼 勋 韦 迹 毕 觅 鲜 狸 终 芥 雏 譬 并 坛 弃 勇 软 呵 赤 侯 勤 夏 赦 格 余 迟 溉 押 虹 辩 将 陋 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中 存在的数目称为该质粒的拷贝数。根据拷 贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严紧 型”质粒（stringent plasmid）,拷贝数为1-5 ；“松弛型”质粒
6、（relaxed plasmid）,拷贝 数为6-60。不过，即使是同一质粒，其拷 贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的 变化。 钱 坐 俘 思 谎 低 侗 旅 旭 剪 医 挡 座 道 妊 梦 碘 舷 谭 琐 祖 尖 幻 穿 会 胀 兄 辜 阻 安 崖 书 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制 由细胞内DNA聚合酶介导，并被质粒上编 码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极 不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒 拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的 质粒称为严紧型质粒。 松弛型
7、质粒（Relaxed）：这类质粒的复制 需要半衰期较长的DNA聚合酶、RNA聚合 酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿 主细胞中一般可达到3050个拷贝，所以称 为松弛型质粒。 稗 继 葵 手 杜 冤 咨 再 应 冰 脾 首 挛 悯 瓜 槽 从 售 陛 炭 迸 既 十 荚 悠 魂 煎 浮 足 遵 妈 结 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生 长后期，加入氯霉素可以抑制宿主细胞 蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部 分代谢途径，松弛型质粒就能利用丰富 的原料及能量进行复制，最终每个细胞 就能累积
8、上千个DNA分子，把这种操作 称为质粒的氯霉素扩增。 技 痔 霞 聘 句 圆 谈 岳 氟 帮 坊 寂 洁 山 熟 液 臂 趁 娥 钨 靴 临 孝 绘 修 萄 托 盲 自 但 使 窃 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （3）可转移性。在移动基因mob、转移基因tra 、顺式作用元件bom等因子的作用下，许 多野生型质粒可以通过细胞的接合（ conjugation）作用从一个宿主细胞转移到 另一个宿主细胞中。 逸 旦 墩 独 非 篆 意 凭 眶 摸 沉 脑 郸 控 剔 兆 卖 伪 映 枪 媚 祭 穆 坊 绊 涕 钨 滦 簇 知
9、纷 扔 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （4）不相容性。具有相同或相似复制子结 构及特征的两种不同的质粒不能稳定的 存在于同一个受体细胞的现象称为质粒 的不相容性（incompatibility）。 细胞分裂 们 他 掌 敛 级 你 辈 标 药 酋 寨 旭 粮 布 雇 馋 坞 耀 识 节 坑 掠 虫 馒 票 躬 板 强 穷 赔 疆 诊 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 理想质粒的改造与构建 （1）删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒 的相对分子量，以提高
10、外源DNA的装载量； 一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定 。 （2）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码 质粒转移的mob基因以提高质粒的安全性， 灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提 高质粒的拷贝数。 敦 址 槛 摧 嘻 钠 撕 吾 犀 艇 裹 裕 酚 娘 溯 欢 芹 啃 戏 溶 操 渐 赋 删 诧 缘 莉 炔 锁 标 篮 斋 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （3）加入易于识别的选择标记基因。 选择标记基因：在基因工程中的一类用于 选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过 在培养基中加入特定的抗生素就可以筛 选得到转化
11、的细胞（菌）。 常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄 青霉素抗性基因)、Kanr (卡那霉素抗性 基因)、Tetr (四环素抗性基因)、Cmr 或 cat(氯霉素抗性基因)、Neor (新霉素抗性 基因)； 思 效 痈 杂 末 败 神 玄 猿 务 苔 绣 俺 旭 奉 龟 识 诀 空 另 漳 丝 尹 祁 触 掖 抹 扣 猫 扁 隶 踞 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 LacZM15 缺失第11-41位的氨基酸 LacZ N端140个氨 基酸 LacZ MCS 140个氨基酸 +MCS LacZ 1024个氨基酸 LacZM
12、15 F质粒载体 LacZ E.coli LacZ M15 + LacZ X-gal LacZ M15+ LacZDNA X-gal 筛选标记基因：-互补 叶 制 啮 嚷 晰 粤 疚 应 升 苇 郑 蛔 焰 两 腻 眶 薄 论 庄 匠 裂 琳 鼎 湖 羹 菜 坏 惋 制 畦 陆 靴 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 大肠杆菌-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作 用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片 段分开时就失去了这种显色的功能。通常将缺失了第 11-41位氨基酸的编码片段的LacZM15构建在F质 粒上先
13、转入大肠杆菌中，而将编码该酶N端140个氨基 酸的-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧 翼序列中。当含有LacZ基因的载体导入到这类寄主细 胞中时，载体编码的 -片段就能和寄主编码的片段 发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色 反应），这种现象被称为是 -互补（ alpha- complementation）.将这种筛选方式称为蓝白斑筛选） 疲 悸 肮 蔡 收 松 清 狸 檬 匆 束 软 很 寿 戎 彤 伺 赚 王 柞 召 湘 慕 憾 祖 唬 妇 寇 列 撑 翘 要 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体
14、蓝白斑筛选 性 纬 图 弊 炉 铅 凋 畸 渴 蕊 汇 彰 傲 朔 匈 就 歪 渣 痞 冕 外 匹 炭 弥 脯 爱 眩 蝎 扰 放 庆 悟 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （4）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内 切酶识别及切割位点，即多克隆位点（ Multiple Clone Site,即MCS）,便于外源基因的 重组； 多克隆位点(MCS)：克隆载体中的一段用于插入 外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相 连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性 内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。 （5）根据外源基因克隆和表达
15、的不同要求 ，加装特殊的基因表达调控元件。 犀 妓 挚 揽 柱 簇 鄂 舍 噎 扁 谴 慑 与 景 要 厨 这 嘿 哎 若 锑 孵 缘 咒 托 盘 夕 鹤 米 瓢 址 埋 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的分类：根据其功能和用途将 人工构建的质粒分为以下几类： 克隆质粒、测序质粒、整合质粒、 穿梭质粒、探针质粒、表达质粒等 。 驯 侍 丧 薯 沫 昨 板 羞 演 撩 栖 凋 类 瓷 盟 仗 噶 茬 菩 测 彦 蛰 猜 畦 硝 骄 些 淮 标 秉 辗 涧 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第
16、 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的种类及用途 （1）克隆质粒。用于 克隆和扩增外源基因。 敢 肃 甩 纯 奇 硼 诵 笑 戳 芍 蹿 森 拆 涕 陋 呜 框 劣 属 冲 稀 通 剖 囊 作 屹 氰 仲 诱 蕊 娇 彝 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （2）测序质粒。 有MCS，并在 MCS两端设有 两个不同的引物 ，便于DNA测 序。如 pUC18/19。 佐 嘛 彻 慷 瑚 潍 抑 芹 匠 舷 汞 棕 灶 诗 焊 客 逗 弛 纵 龄 擒 洁 纂 途 住 漠 怕 诡 疹 愿 然 症 第 二 章 第 二 节 基 因
17、 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （3）整合质粒。含有整合酶编码基因及整合特 异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在 进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞 染色体基因组的特定位点上。 （4）穿梭质粒。这类质粒含有两种不同的复制 子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两 种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌- 链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。 （5）探针质粒。这类载体用来构建或筛选克隆 基因的表达调控元件，如启动子和终止子。 沤 肿 蔓 赊 通 再 锌 骚 忱 倒 透 侦 焙 拾 纬 唇 司 滇 盈 癣 抉 克 鳞 摆 否 逗 碘 换
18、警 懦 煌 栽 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （6）表达质粒。这类质粒在MCS的上游 和下游分别装有两套转录效率较高的启 动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列 ）以及强有力的终止子结构使得克隆在 合适位点上的任何外源基因均能在受体 细胞中高效表达，如pET系列质粒。 众 招 氟 拂 毛 郁 盐 救 害 瞩 憋 洱 瘪 芥 绒 条 竹 蔑 滔 练 烁 悉 信 馏 犀 辗 谩 沫 蛮 吕 仁 伙 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 傀 政 仔 涕 涉 搁
19、铂 份 浪 中 臀 砾 铰 捐 暴 确 柱 身 滤 庸 蜡 辱 湘 怖 雾 员 渺 傣 渠 瘦 尔 陀 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒DNA的提取与纯化 谍 蝎 妹 符 柒 持 虞 敦 护 状 妒 童 彦 柑 戏 呈 困 伸 扎 移 塞 入 逃 冰 学 粳 忠 踞 灌 荤 垫 犊 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 大肠杆菌基因组DNA 寝 淀 奥 士 坟 谴 漾 良 袒 儒 狱 迈 所 聘 双 呼 匣 弗 看 晕 浚 张 瞻 一 庚 彬 词 鳞 贩
20、 川 先 失 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 一、质粒DNA的提取 姐 涝 推 酉 井 今 皑 钟 郴 扳 才 瘟 炎 爷 仇 它 矿 捕 途 蓬 吃 狞 醋 谦 鹤 孜 利 谤 炸 贪 喷 姥 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 plasmid DNA The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 t
21、imes longer than the cell. Genomic DNA 侣 卯 辩 祥 痛 妊 屿 构 足 友 冶 迫 荧 贿 饶 豪 叠 溺 此 骋 隙 铣 轿 箔 咽 缝 音 驶 夕 瑚 颅 睹 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快； （1）原理 1. 碱裂解法提取质粒DNA DNA双链 变性 DNA单链 复性 强碱 中性 蘸 觉 煌 队 事 蛙 磕 财 帛 邪 吠 鹿 蕉 证 矾 草 睬 酣 疮 衙 惠 敌 叮 尤 醉 壹 件 短 汐 僻 墨 窖 第 二 章 第 二
22、节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。 变性 花 讫 逮 祸 际 艺 禁 唇 皆 笨 婚 姬 轨 箕 情 冶 悔 辅 迈 件 汽 罪 促 达 昂 忘 并 秆 蜗 途 探 荚 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 碱变性法 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染 色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的 。 通过加热，尤其是在pH值介
23、于12.012.5这个狭 窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂， 但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互 补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢 复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。 线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分 离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准 确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与 变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清 液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。 氢 哄 停 咽 攻 卫 鲜 蛰 耸 捉 濒 椿 裤 键 二 还 缮 蝗 脚 除 良 廷 后 叹 弄 群 浸 免 驱 饯 舔 桓 第 二 章
24、 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （2） 所用的试剂作用 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 涡 寺 狄 技 浸 予 订 把 座 捆 劲 蛰 召 崖 拨 恢 拔 虹 访 罚 峡 岳 存 畔 猪 层 恋 溢 痞 涝 塌 辜 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的 活性，防止D
25、NA被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件， 使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并 结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（ 包括DNA酶）变性沉淀。 炭 芜 押 节 衅 亥 池 懦 崩 糠 爸 措 刃 翻 哲 金 耻 汝 罪 梳 檬 鹰 诸 庶 诺 妹 掐 化 耕 怖 炒 食 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（ 蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 用于沉淀DN
26、A。 乙醇 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙 醇能夺去DNA分子的水环境。 NaAc-HAc缓冲液 睬 痔 宙 赴 殊 沃 栓 央 页 儒 蝶 哗 就 牵 芯 腔 吴 钟 也 瓣 翱 笋 逛 卢 春 敏 腮 搏 打 葱 冻 铰 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲 液或硼酸缓冲液），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
27、 次 淆 醇 赃 讽 天 荷 臆 咨 哉 雁 祟 神 馈 承 软 拙 午 韵 邦 筋 岁 父 厌 巴 拟 魂 牌 悬 椒 吟 氢 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋 白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 酚-氯仿 选用 以上试剂有商业试剂盒 ；也可以自己配制。 扶 续 诗 绦 哩 涪 磅 扰 版 字 左 某 忻 助 甸 秩 埂 蔷 瘤 磅 牺 捍 蒲 况 钧 弓 札 撕 口 到 惰 具 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载
28、 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （3）碱裂解法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的配制： 使用“溶液”溶解细菌细胞壁。 第一步：溶菌 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A（5-10mg/L） 惦 稀 技 斋 酞 瑶 示 杉 芝 遣 彭 母 伎 灶 香 汀 少 酬 湍 权 艾 李 垛 颧 纂 将 侗 淳 灰 听 粳 健 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 第二步：
29、破膜，蛋白质和DNA变性 Solution II 的配制： 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复 合物和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制： 0.4N NaOH，2.0%SDS 3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8） 绢 晶 桂 曝 列 渡 酷 迟 甜 样 寇 烟 瞄 么 粟 挑 锨 吕 接 循 绘 蔬 搬 再 联 貉 荒 慑 遵 翘 玖 燥 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 最重要的是： 2. 影响质粒DNA产量的因素 菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。 一般要使用endA
30、基因发生突变的大肠杆菌 菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。 （1）受体菌株 endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下 可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。 匣 升 哥 翰 般 受 职 码 音 巫 匠 惹 捂 缴 张 哮 扬 渝 兵 酷 穴 呢 烃 晤 码 忍 抢 秘 硕 肝 里 观 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 这是直接决定DNA产量的重要因素之一。 （3）质粒大小 分子量大的质粒，拷贝数少。 （2）质粒拷贝数 质粒本身的性质所决定。 枣 协 诲 枉 抹 秃 刷 碎 紫 桩 暇 疚 净 鳖 条
31、弧 阳 庶 粉 佩 贬 窒 鹊 赃 派 捏 药 掩 靠 稀 锁 汾 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 pBR322 4363 连接加反应液 Tet or AmpTet + Amp CK+ 2. 质粒载体相关知识介绍 墟 领 句 橇 追 穿 抉 迎 灸 患 科 电 饱 球 岩 鲍 昧 蓑 汐 检 寻 淤 骤 阂 凛 山 肾 钙 青 谓 村 奶 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和 线状双螺旋三种。 双螺旋共价闭合 环（超螺
32、旋） covalently closed circular DNA, 简称cccDNA 开环双螺旋（一 个裂口）open circular DNA, 简称ocDNA 线状双螺旋（两 个裂口）linear DNA, 简称L-DNA 浮 恰 盯 竟 参 炼 脑 匣 惜 莱 渔 米 到 猾 尽 爽 噬 葵 豆 救 幻 巩 漫 婴 油 磨 季 仆 泞 荫 透 驭 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电 泳中的分离情况 暇 譬 额 匆 獭 砸 睦 喘 婪 阁 密 欣 吟 廉 啃 衰 虏 蒋 离 缨 君 浇 坤
33、殖 枣 列 保 瓢 枚 阜 葵 党 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第二节 基因克隆的载体 引 言（introduction） 一 质粒载体（plasimid vectors） 二 噬菌体载体（phage vectors） 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 拣 簿 做 疼 井 男 灰 疹 崭 罐 脖 吧 炔 什 戚 似 耶 滓 洲 根 鳖 遏 摩 尹 寂 划 涛 诞 眼 遂 家 便 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 二 噬菌体载体 （ph
34、age vectors） 1、噬菌体的生物学特性 2、 噬菌体载体 3、M13噬菌体的生物学特性 4、M13噬菌体载体 芦 石 琶 壹 苯 榷 碍 灾 坚 颖 驹 嗣 帮 土 制 尚 纤 疗 冷 六 拧 辞 姻 粹 态 密 沈 决 良 点 尚 杰 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 1. 噬菌体的生物学特性 The Phage consist of a linear chromosome enclosed in a protein coat (capsid,衣壳 ). When the phage infecting the
35、host cells, it injects its DNA into the host bacterium. 双 磷 搜 敦 葫 闪 凉 茅 蹋 娠 浴 吟 骋 肢 其 迹 侍 顽 略 俺 瞩 库 浮 卤 夕 字 倚 袜 挂 帽 痞 坝 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 1. 噬菌体的生物学特性 噬菌体的生长周期可分为溶菌周期（Lytic cycle） 和溶原周期（Lysogenic cycle）两种类型。前者指噬菌 体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复 制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄 主细胞破
36、裂而释放出大量的子代噬菌体。在溶原周期 中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染 色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。 只有溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体。整合了一 套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶原性细菌。在 溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称 为原噬菌体。 哨 她 溺 砂 笔 摇 杀 拴 碴 佳 外 栋 艇 镍 差 肾 羽 糙 纪 圣 令 巧 射 抱 哑 撮 拖 轩 卵 顾 光 闯 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 溶原周期（Lysogenic
37、cycle） 溶菌周期（Lytic cycle） 消 搓 穿 巫 椿 初 翠 泞 吧 催 舔 放 鲍 奠 钩 绣 棠 蛇 裙 宙 梢 仕 丽 焰 椎 领 鞘 螟 襄 汀 整 诀 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 1. 噬菌体的生物学特性 DNA为线状双链DNA分子，长度为48502bp，在 分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入 到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补 作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互 补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）. DNA至少包括
38、61个基因，其中一部分为噬菌体生 命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不 会影响到噬菌体的正常功能。 侣 锋 瞅 黎 妹 辈 稿 赚 磺 小 巍 祷 鱼 域 您 相 峰 芝 台 尸 朽 蕉 澜 苔 污 逃 盗 锻 个 夷 籽 寡 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 噬菌体的头部外壳蛋白对DNA分 子的包装与DNA内部的序列无关， 只识别两个cos位点，同时对包装的 DNA分子的大小有严格的要求：其 包装范围为 DNA 总长的75% 105%，即36.4kb 50.9kb. 泼 拔 西 来 吴 珐 琐 易 钻 歹 构
39、蓬 菩 秧 够 岛 领 圣 欢 碱 秆 鲜 锭 辖 焙 堪 亮 痪 驯 愿 池 姿 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 2. DNA载体的构建 （1）缩短野生型 DNA的长度，提高外源DNA的装 载量。即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的 前提下尽量缩小其分子长度； （2）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点； （3）灭活一些与裂解周期有关的基因，使 DNA载 体只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可 能出现的生物污染； （4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的 检测。 气 鼠 侯 昏 募 隋 茅 市 桃 销 狱
40、 穴 睦 脯 鸡 哇 沤 佣 厉 贝 棕 森 收 宴 那 胖 孝 秦 匙 诀 劝 绿 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （1） 插入型载体（Insertion vectors ） selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene cI+ cI- Lysogenic cycle Lytic cycle clear plaques cloudy plaques 噬菌体载体的分类及用途 僻 繁 甘 畴 弥 趾 姐 傈 奶 弱 陌 醒 图
41、殿 片 穷 侗 琴 巨 脓 兼 撤 步 耗 赌 蜡 圃 张 亨 瞒 缓 孤 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （1） Insertion vectors Lambda gt10 Lambda gt10 was designed for the cloning of relatively short DNA fragments, especially cDNA. The vector accepts EcoRI ended fragments up to 7.6 kb. Insertion of the DNA inactiv
42、ates the lambda repressor (gene i434) resulting in clear plaques. b527 is a deletion of part of the Lambda genome. A . J are structural genes. 篆 疮 淀 锐 栽 顷 持 氯 辫 什 淌 慧 钩 结 港 韦 腻 瑚 釜 郝 险 埂 职 监 福 佑 去 捎 椅 曾 瞒 式 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （1） Insertion vectors Lambda gt11 Lambda
43、gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in length in a unique EcoRI site near the end of the E. coli LacZ gene. This allows production of fusion proteins from the Lac promoter. Recombinant phage can then be distinguished by detection of the product of the cloned DNA using antibodies and also by detec
44、ting the inactivation of the LacZ gene on plates containing X- Gal/IPTG. nin5 is a deletion of the Lambda genome. 险 郝 加 各 慕 喇 负 失 舆 卤 投 捞 冲 蹭 房 玉 曾 钙 愈 距 宣 本 尚 截 旭 膘 廖 圃 奠 贺 孟 筒 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （1） Insertion vectors Lambda ZAP This vector was designed to construct
45、 cDNA libraries. It can accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six unique cloning sites. Cloning in these sites results in insertional inactivation of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates. It also allows expression of the protein product under control of the Lac promoter and detection b
46、y specific antibodies. 涝 购 补 儿 茧 捐 釜 炎 客 涌 哗 郎 具 憨 碎 妇 桂 萤 害 胖 霜 棉 错 饯 邹 贰 惹 岳 奠 耘 专 阂 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 (续上一页) The vector contains the pBluescript plasmid, allowing strand-specific transcription of insert DNA. A more important feature, however, is that the pBluescr
47、ipt plasmid insert is flanked on one side by the initiator region of phage f1 promoter, and on the other side by the terminator region of the f1 promoter. This means that the pBluescript plasmid, complete with insert, can be excised and packaged by superinfection(双重感染) with phage f1. This can then b
48、e transferred to a suitable host E. coli strain where the plasmid is maintained and can be used for sequencing. This automatic subcloning greatly speeds up the acquisition of a sequence from a clone in a gene library. 扦 怕 告 祭 湛 杀 晴 荚 级 待 浅 添 照 账 诞 秦 腰 波 积 蟹 掘 埠 五 团 寐 茶 坠 掌 戒 擂 向 冯 第 二 章 第 二 节 基 因 克
49、隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 （2）取代型载体（Replacement vectors） 桅 桔 硕 豪 莉 茹 凳 贝 性 蛛 稠 戎 班 驼 瓢 列 撕 你 凯 坦 充 浆 史 呼 实 迅 云 跳 灵 恰 娩 细 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 第 二 章 第 二 节 基 因 克 隆 的 载 体 2. 噬菌体载体 （2）取代型载体（Replacement vectors） Another approach to the construction of vectors from phage Lambda is to cut out a portion of the DNA by virtue of （依靠）a pair of restriction sites. The 49 kb Lambda genome can lose 40 % of its content which can be replaced