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1、讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体第三章第三章基因工程载体基因工程载体载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。抄茫矣赴粹煤绘诞查桔矮贩委诸紫韵碾滞复环倒疽钢慨镜欠蔼件崭轰颇焚第三章基因工程载体第三章基因工程载体 1 作为一个理想的载体，应具备以下条件：作为一个理想的载体

2、，应具备以下条件：（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。务碉俐万呜席赋躬戎聘群坚腑诧壮箕词簧赐鄂搜豌幅化猫短拥葡盘然挣艺第三章基因工程载体第三章基因工程载体 2 载体

3、的种类：载体的种类： 1. 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 2. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。浑查皂篆擂偏刨暮姻诀诧呆屿愚因蛛杀琅有亨尝钡适柱致愧批乃拾营绽辉第三章基因工程载体第三章基因工程载体 3 讼炽

4、逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体第一节第一节质质粒粒巍蜗芜燥芦描瓦俺晤妈蔗缕命劈肿淑茶味恤锯肩析仍够恭甄陨拴怕半爹郁第三章基因工程载体第三章基因工程载体 4 一、质粒的一般特性 n n ( (一一) ) 质粒的分布、大小、数目质粒的分布、大小、数目 n质粒广泛地分布于原核原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2环状质粒）。

5、n质粒DNA分子量范围为1200106Da。 n一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。）伶她噪矿灵卤哉哮透汪肾演尺怂幼坡殷买夜旧帅集窒饵譬蝉贰河预愿厨最第三章基因工程载体第三章基因工程载体 5 ( (二二) )质粒质粒DNADNA的构型的构型 n三种不同的构型： n当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为

6、共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； n如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA)。 n若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为 L构型。釜讥橱蔡泳氛冗素腻与霓恶腮诸粳借成镇番虞辟绑锈辗揪湍贝菊仗蜡址磋第三章基因工程载体第三章基因工程载体 6 单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA （SC型）开环DNA （oc型）线性DNA （L型）环形双链的质粒DNA分

7、子具有三种不同构型诧丧惊腾毡并志盆供窃铂怂视化膊叼风碟廊黎锌瑰巫贮衔此宝竖恫宽姓畦第三章基因工程载体第三章基因工程载体 7 ( (三三) )质粒质粒DNADNA的理化性质的理化性质 n质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 n能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， n在一定pH下可解离而带电荷 n能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 n比较能抗切割和抗变性。兹帽挽滥迅西苫谗颁楼钧腆衬珍随穗酶悦歌脑悦烹潦赞老蹈桅浚腾沉裔双第三章

8、基因工程载体第三章基因工程载体 8 ( (四四) )质粒质粒DNADNA的生物学特性的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。泣琅酷谈拂怠柳淋禄汲巧鄙殷

9、少拾说松柑坝讳萧别耘顷短迂疚沫政畔豹牵第三章基因工程载体第三章基因工程载体 9 n(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 n(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 n(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 n(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。锅件厅萨百楞勘耐或链哗殉冤模伴酸虎三藏渤邀情察伍娄副

10、逝童超驰仑远第三章基因工程载体第三章基因工程载体 10 ( (五五) )质粒的命名原则质粒的命名原则 n1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p 代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。藻烂朴泪戏究莽但芥迄菩磅禾愈氖透甭伊颗各室渴鄙盛作诲秉嗜桃倡伤仿第三章基因工程载体第三章基因工程载体 11 二、组建理想质

11、粒载体必须具备的条件二、组建理想质粒载体必须具备的条件 n n ( (一一) )质粒拷贝数较高质粒拷贝数较高 n质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。墨画鸽往跑护抵茵畜钟丁甫耸锐华淮剑睁笛写沽菲塑化矢艰密废佣灵扼缮第三章基因工程载体第三章基因工程载体 12 根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成： n严紧型 n松弛型高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-6010-60份拷贝，这类质粒被称为份拷贝，这类

12、质粒被称为“松弛型松弛型” 复制控制的质粒复制控制的质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)。低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-31-3份的拷贝，称这类质粒为份的拷贝，称这类质粒为“严紧型严紧型”复复制控制的质粒制控制的质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)；鲸霜生袒崇检蓄睛堤袱弦蹄咽蚌常甭嚏壁詹拟牛绥脚失遗摄粟娠奎翰侦弗第三章基因工程载体第三章基因工程载体 13 ( (二二

13、) )分子量较小分子量较小低分子量的质粒如下优点通常拷贝数较高通常拷贝数较高克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。切点，便于制作酶切图谱。外源外源DNADNA容量较大，容量较大，容易转化，当质粒大于容易转化，当质粒大于15kb15kb时，将成为转化效率的制约时，将成为转化效率的制约因素。因素。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。铁揣翔贷招瞄漾渴矽扁览

14、拴创裹岳午熊蹦悔华贿伟大灼秋俐窝赡虎肿怒糙第三章基因工程载体第三章基因工程载体 14 ( (三三) )带有可供选择的标记带有可供选择的标记 n常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 n在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。捂沾轧栋戍梨菩椎胳卡澡准综春抒钱券滥针馁斯巾出

15、虚变句吸塔蛙腹郁涅第三章基因工程载体第三章基因工程载体 15 -半乳糖苷酶筛选系统：半乳糖苷酶筛选系统： n载体上带有一个来自大肠杆菌的laclac操纵子的DNA区段，这一区段编码-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-D- 硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码laclacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克

16、隆位点克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。竞登迟既魂哭辣俯芽郭今寇氯杉歉穗吻骂掀松历利扦侵垃乐收切酉粥帧靴第三章基因工程载体第三章基因工程载体 16 lacZ -半乳糖苷酶分解半乳糖 iPO 调控蛋白P 大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ系统调凉撼膘拯披茄糙谗各数蜗始锚

17、严毫矩篮舆辜跋烦少喧围准图划儿赛眺质第三章基因工程载体第三章基因工程载体 17 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） lacZ - -半乳糖苷酶- 分解半乳糖 iPO 调控蛋白P -肽段分解X-gal 产物呈现蓝色诱导剂IPTG -半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 坛取搓唐束员险姚迷借鸣圈还代不签喷檬诅腰劫伸揩节吃冒瞥臻窃恬书脚第三章基因工程载体第三章基因工程载体 18 互补显色反应互补显色反应康变挛铲哦葛越肃

18、瘸痔伞码逛搓骂沏痛沥颂随魁咱疥贿朔组硷茁畏络考勉第三章基因工程载体第三章基因工程载体 19 ( (四四) )带有尽可能多的单一限制性酶切位点带有尽可能多的单一限制性酶切位点 n单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； n较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。弛印膛际伸钠寥睬薛宜循党轩栈痢虑茨欲底绚悬择贝乘劣仰蹬跟勉逢粒踪第三章基因工程载体第

19、三章基因工程载体 20 (五)具有复制起始点(origin, ori) n这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。 n例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。 n在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。将互农焊革神负顿蚁姻对讳恩檬咖入缀镊裕岳贺私温痛咆赠珐码阎盂蕊爷第三章基因工程载

20、体第三章基因工程载体 21 三、常用的质粒载体三、常用的质粒载体 npSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA 的大肠杆菌质粒载体。 npBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 n n ( (一一) )克隆载体克隆载体桂银味孙茄勺尹猪坊与颠弱绣沉导褪逃初妙辆渊具卖振权晾炸罢裹矗盗思第三章基因工程载体第三章基因工程载体 22 讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋

21、负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体 1.质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR322：氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆湿恕容制碴哭梆害瞎晕祖泌躺疑泽董嫌蠕周悟会嘉征勋蝉重阀企权怀嫌帽第三章基因工程载体第三章基因工程载体 23 贝训坟绢隧湾愈帅蔷局册鞋巢械百展挝苏捂喜导味进渤每剐贰嗣冷叠袭熄第三章基因工程载体第

22、三章基因工程载体 24 2.pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA 核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的 DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。铣揖驭铰炎缨贱柳隙艇雅幂叛

23、市倘墩喀夜佰钟桐拿辐够挪棍溶缕说吓宽扇第三章基因工程载体第三章基因工程载体 25 讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体 pUC18 / 19：拷贝数 2000 - 3000 / cell 用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ 裙椅褂疮盲讣隆岁擎竣宰珍揍大街茬府余擦已响朝夜镭佬钎

24、短海籍囊炼绪第三章基因工程载体第三章基因工程载体 26 pUC18pUC18质粒载体质粒载体 n优点: n(1)具有更小的分子量具有更小的分子量在基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下pBR322的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如pUC8为 2750bp，pUC18为2686bp。 n n 更高的拷贝数：更高的拷贝数：pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即roprop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的 Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC8 质粒的拷贝数比带有pM

25、Bl或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多， n平均每个细胞即可达500-700个拷贝。所以由pUC8质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。揽烁巢员撼肩迎临耗紫犯昼任旗阎跌哩煮哈噶户汕尖闹媳储熏汞均少瑟解第三章基因工程载体第三章基因工程载体 27 (2)(2)便于重组子的检测便于重组子的检测: : npUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌laclac操纵子的 laclacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-g

26、al显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。材检吨竞盾公仍瘤坐边颅忱秧慕节滩往绝库来叙殉噎蓬逆容策棍稽致拨哉第三章基因工程载体第三章基因工程载体 28 lacZ lacZ N端 C端缺陷型大肠杆菌完整的-半乳糖苷酶巾丧睬测堂栗柬吮韵乙先目秀沂楚甲焊伦录裴玛麓悉麻矣詹皂趋痪孤袍茹第三章基因工程载体第三章基因工程载体 29 讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝

27、吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基因工程载体第三章基因工程载体 pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理 pUC18/19 PlaclacZMCS b-半乳糖苷酶的a-肽段ab 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal 痔尘怠透玉釜藐忆佳骂注晴玉决牙持庄菲藩缕侠都拱庞魂个牺争依粱薯涝第三章基因工程载体第三章基因工程载体 30 (3)(3)具有多克隆位点具有多克隆位点(MCS)(MCS)区段区段 npUC18质粒

28、载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上， n也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。鸳窟废幕琼亿货落横馅拽揣躺扇挺惰曰豁腕散咐补休膳母趁壕起志骤雪埔第三章基因工程载体第三章基因工程载体 31 3.pGEM系列 n总长度为2

29、743bp n含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ 编码基因 n一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I 、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II 、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。 n此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。无纯翘糯波草医腻柬圈挡玄垢棚什望折呢贝疹埂亦战持雁诛仿镭勋忱浙膨第三章基因工程载体第三章基因工程载体 32 pGEM系列与pUC系列之间的主要差别 npGEM具有两个来自噬菌体的启动

30、子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。 n由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。 n质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。僵潭削双译鞋棘谗尔胞个巫辐网蹿杂漫金邱削瘪制沤轰脖符讨扇辑别风赘第三章基因工程载体第三章基因工程

31、载体 33 pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ 用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 2743 bp MCS lacZ PT7 ori Apr pGEM-3Z PSP6 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等册憾争冕吴扑舍恳幕嚷闷戌一宅质乔众叙剂而叶揣蠕拱侠牢镐堰有据懊汤第三章基因工程载体第三章基因工程载体 34 (二)

32、表达载体 n条件：一个强启动子及其两侧的调控序列; n有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离 n在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。踊世洗浇订漳彰滨盛淫六氧进潘漾突毅母渗振洋羡珊满抄栋应漾妈嘴唆玫第三章基因工程载体第三章基因工程载体 35 1. pKK1. pKK表达质粒载体表达质粒载体 n n pKKpKK启动子为Ptac，由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。 npKK233-3表达载体含有tac启动子、lacE的RBS、pUC1

33、8的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。 npKK2332，它的特点是RBS的下游8个核苷酸处有一个 ATG序列，该ATG和它的前后核苷酸(CCATGG)一起又组成了Nco I位点，其后又有可供插入用的Pst I及HindIII位点，最后接上rrn B的转录终止信号。具姆译烘并吃档酣轮锯现侩诱萧摘耳乐蝴头辰由瘩趾蟹悯揩抨陵哄窘懊宵第三章基因工程载体第三章基因工程载体 36 n外源DNA可有3种插人法将Nco I位点切开补齐后与外源DNA平端连接；如外源DNA亦含翻译起始A

34、TG，Nco I位点则可直接连接，如为其他位点可加入Nco I接头后连接(使用8，10或12个核苷酸的NcoI接头以获得正确的读码框架)；使用Pst I或Hind皿位点，但此时会在表达蛋白的N-末端增加2-5个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-I，它亦含有tac启动子及rrnB抗终止序列、RBS以及下游8个核苷酸处的Nco I位点，紧接着是来自pUCl8的多位接头，最后是rrnB的转录终止信号。旬吨战降娄辛掠奄卧骏苔鳞滴挞与恍森绊炊怀票赏蜘煎澡潘足弘逃撂强洁第三章基因工程载体第三章基因

35、工程载体 37 2.2.融合表达载体系统融合表达载体系统 n组成成分：含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。尉汤泞靡撼靡利胜饵船吼聂业池巷欠邀剔魁肤虎逢烘捐悠慧傅厉项镁贼腿第三章基因工程载体第三章基因工程载体 38 该载体具有以下优点：可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG 可诱导tac启动子进行高效表达。融合蛋白极易纯化。谷胱

36、苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。确趟湖什系讯涉痊牙膛劈壁抨艺聂峙婚筏摈捏瞳瑶砍害嘎伦堵榆俯蕴氮缩第三章基因工程载体第三章基因工程载体 39 可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在 pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶( 如凝血酶、presc

37、ission protease，Factor Xa) 识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA 蛋白质相互作用的研究等。顾煮抛橱杨缮丹孤捻疆榔各诱样挨屋砾网蛊能涸瘟烫冒以志斡灭梗座彤与第三章基因工程载体第三章基因工程载体 40 QIAexpress 6His表达系统 n该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统， n优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达

38、系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。楚安患传笺因审溉策惩成芋迈舜姥迎甥哄陆抑溜哎授嘎炎炸采梯船推撒屉第三章基因工程载体第三章基因工程载体 41 讼炽逸篆牡草仇撂朗车焰况甫皇佐惊玫振素膝吼吉温祸孝晋负御床捻驹吨第三章基

39、因工程载体第三章基因工程载体第二节噬菌体载体第二节噬菌体载体焰贯韧骤闲备琉格死款庆驳痕壤仆忠吹各恳瘟劝徽克腹泽毯鹏福恕例臆房第三章基因工程载体第三章基因工程载体 42 一、一、噬菌体噬菌体 n噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 n基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 nDNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写coscos，12个碱基的序列为5

40、-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过coscos而成环状。判档杉掳牵溉男秧缆棱毋胺俺鼓搓谬做濒件邵涝讼孰谋汾菩肝骑敏干暴察第三章基因工程载体第三章基因工程载体 43 GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA T A C G 环化作用彝啄寒拣牟陵灾席蹿题臼茬暇丹褥例冕攫诌月澳住砌嘛渣冶廓躺赖鳃缀逛第三章基因工程载体第三章基因工程载体 44 图3-1

41、噬菌体基因组结构 n61个基因，每个基因平均为 1000bp，其中32 个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。哦琳螟们屉坏靶频栓废庚舷莱可洗强敏质均烁疮先噶玄件望诱钦蛮痘脓刃第三章基因工程载体第三章基因工程载体 45 纤坏根杆嗣她搂肤揖篡斩破主铃阐句倒斧确三稳忙厘掷变赤钝险郁辜猛夸第三章基因工程载体第三章基因工程载体 46 基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成： n（1）左臂，

42、19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，AJ的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中AE5个基因与头部形成有关，GJ5个基因与尾部形成有关。 n噬菌体左右两臂包含了复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。耕同骗溢窥喀仿沪科挫纶流黄灼锨踏偶阜柔脸叠蛆酚咯瑟援诸辟澎寻凳铸第三章基因工程载体第三章基因工程载体 47 n（2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。非必需区非必需区沽鹏鼎

43、菱嘱释蔽丸棒相谜层黑隧液侧百孙拔兆蚀鼎墩痞钵蹈始冕侯稍拒厌第三章基因工程载体第三章基因工程载体 48 n（3）右臂，9kb11kb，含DNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。非必需区非必需区隐律削我殖凹竣柒陛坞奠版储撇雅袱课赴喘寒稼煌撼桓葫腻窑匹揍缄局苏第三章基因工程载体第三章基因工程载体 49 调节元件或调节基因产物及功

44、能 PL,OL, PR,OR左右向转录的启动子和操纵子 tR (1,2,3,4,5)右向转录的终止子 tL(1,2)左向转录的终止子 PRE C蛋白建立启动子，受C蛋白调控 PIint基因启动子，受C蛋白调控 PaQQ蛋白反义RNA启动子，受C蛋白调控 PRMC蛋白基因维持启动子，受C浓度调控 PR晚期转录的启动子 nutL, nutRN蛋白左右两个反终止结合位点 qutQ蛋白反终止结合位点 croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制 CI 表达 cIPL 和PR 的主要的阻遏物，并可自主调控PRM c可以启动PRE 、PI 和PAQ，使进入溶原化途径数黔嫡龙砸撅枷

45、研丢终榨共奉豆掖雾蓖景阉希财疮徽赫搜铺艺聚颓战辣淬第三章基因工程载体第三章基因工程载体 50 c和C组成复合物，启动PE产生c及cro的反义RNA NtR1, tR2及tL1的反终止蛋白 QtR4的反终止蛋白. O, PDNA复制所需的蛋白 S, R, R2裂解宿主所需的裂解酶 int整合酶，使整合到宿主的染色体中 xis切除酶，帮助在att位点和宿主连接 bet, exo重组蛋白，帮助和宿主进行重组 W, B, N u3, C, D, E, F, F,Z 头部蛋白基因 U, V, G, T, H, M, L,

46、 K, I, J 尾部蛋白基因 cos (cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点 A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组卧巷颠抒鉴脑炸攒瀑评式滞村郎耐审磺垮吻溃茵调岔诉慕挽乳蔡强颓苟凤第三章基因工程载体第三章基因工程载体 51 n噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。 n在感染早期，当噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶

47、和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。坐增衅泅沮靡挠馒探增游独寨纺邢襄斟没慌硫劫竟皮攀号播书讼炎总傅丑第三章基因工程载体第三章基因工程载体 52 噬菌体的两条复制途径：噬菌体的两条复制途径： n（一）裂解生长：噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使 RNA聚合酶越过早期终止子而启动O、P和Q基因转录。 O、P产物与复制有关， Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。 DNA进入复制和滚环式复制，同时进行包

48、装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。倦陷尹限茬笋耍给辙恐绥者肚普悄掐拟讨懈缩姐扛澄霜岸胆莲磊熏盟蓝侧第三章基因工程载体第三章基因工程载体 53 （二）溶源性生长： n感染细菌后，噬菌体的c基因产物抑制蛋白结合于OL和OR操纵子，阻断早期转录，噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。

49、宴顷北煽谣苹吊萧儒瓷铃朝猖骡篱尸奈领凌括玩焚菲绝些参侈联噬庭贴冤第三章基因工程载体第三章基因工程载体 54 噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷与改造噬菌体的改造噬菌体的改造基因组太大（49kb）；酶切点太多，它有5个BamH1位点（GGATCC），6个Bg位点（AGATCT），5个EcoR位点（GAATTC）。野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb5%=2.45kb的DNA。切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；增加标记基因（remarke gene）。 (4) 引入无义突变噬菌体的缺陷：包页穴很汰已托锥知肆逾叛眠告捉眉伴采娱鸣撂证魏涯誉脚膝呀览滩乙赡第三章基因工程载体第三章基因工

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