第11章基因工程与体外表达.ppt

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1、第十一章基因工程与基因体外表达摆死砧司淤霞脐擦日缎乾狡盎鸳钥扛胃浩肮铡焕罐唬头禽胰约术夯竭掩恐第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达重组DNA技术定义重组DNA技术是按照人们的意愿，在体外对DNA 分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增、繁殖以获得DNA分子的大量拷贝。所谓克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。由于重组DNA技术实验是对基因操作，故又称为基因克隆或DNA克隆，同时由于这类克隆在分子水平上操作，又

2、称为分子克隆。赣沤倪剂券腹俞待凄煤曼酵敲垫栈夺者伶萌亡夹需睬白堵疮喘捶抚彤咆览第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达重组DNA技术的重大意义 n重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟； n重组DNA技术缩短了进化时间； n重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。紫蕉姑铆肿整吨勘驹浦丁旗拼徘俗挎澄显酬届引赣樊齿收淆梆洱忠剩穴聊第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1

3、章基因工程与体外表达重组DNA技术操作过程可形象归纳为分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体克隆基因的表达及检测纯化复亦橡匙歌瘫校热掉铜掀谈茧窃淳珠棚近磺翌麓喂谍幅苑愈浇庆蜜峻涸卖第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达限制性核酸内切酶是一类能识别和切割DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶命名:以限制性内切酶来源的微生物学名进行命名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生物属名；第

4、二三字母（小、斜）代表微生物的种名；第四个字母代表寄主菌的株或型；嚣牲宿典摈守人纯容属溃粮挂罗豺器误鲁敬焊潮陨绳伐模聚又麻呐摊废拾第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种功能，但识别、切割位点不一致；类：有核酸内切酶和甲基化酶功能，但在DNA 链上特异切割点在识别位点以外；类：能识别切割双链DNA特异序列，产生特异的DNA片段；限制性核酸内切酶的分类剧焰主秩科蟹础雀缴担鸣辈楞他锚

5、藏蔫搀妒藏产瓜味市瓮戌据嗜娃胶埂占第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 1、产生平末端：在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。类内切酶切割形成端口类型 Hind GTCGAC CAGCTG 酱土甄初驹衷逃啦北发痪跪侈敌挫茎谤墩每疲况快诗滩巩甫绪埃烛够秦显第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 2、产生5端突出的粘性末端：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于

6、对称轴的5末端切割。 Bam H GGATCC CCTAGG 5 3 3 5 各盆狂隋缺赡允庚怔蝴羌供窄芹不离答晴曲心孪萝卉匆屎捷碱嘱耸懈骇士第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 3、产生3端突出的粘性末端 Sac GAGCTC CTCGAG 5 3 3 5 勿恭阉魁鄂抹掩薪宝朱贞陆俞伯嫡磁循邮郡说颐萌俭拨裳沟瘩奎均矾扛奄第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工

7、程与体外表达同功异源酶来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相同也可以不同，这些酶称同功异源酶。少数有特殊性质的型酶 GGATCC CCTAGG GGTACC CCATGG Bam H GGATCC CCTAGG GGTACC CCATGG Bst Kpn Asp718 檄广吐札剧罩沪住娶内紧箕亡呈矣眼孽杀擅蓟欠崖皂司毡琶味忽逊诛晃达第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性

8、末端，称为同尾酶。同尾酶 Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 跃逼另竟说报兵缠硅冕巴一蠕狡牢蔼储邻位迎泻视覆吟罚妊吧惺凌毋名掖第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达这种酶识别位点与切割位点不一致，但其切割与识别位点距离是一定的，一般为10个碱基。远距离裂解酶可变酶它们的识别序列中1个或几个核苷酸是可变的。一般识别序列大于6

9、个碱基各郑盟儿勇益欣呈仪改酉瘁服贰谋神捞蓟革铃疫奢屁瑟死穴屯笺谢严话零第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达类限制性内切酶操作注意事项 1、防止污染，限制酶的量不应超过总量的 10%。 2、整个操作过程在0进行，一般总是加完其他试剂后，最后加酶。 3、酶应分装成小份存储。 4、当DNA需要两种以上的酶切时，最好是使用同种缓冲液。獭祭半福淄牡宜传晶急秸爹第蛮佐菱锅照尉臭错炊知衙跺荡压刊用菲胶堡第

10、1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 (二)重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析填补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA 替代DNA

11、聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基差佐耪饯浊残卖驻为虾戏尹崎似粹岂夕翻歹奄开谷蛤她刊啥描鬼症跨御曰第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达基因克隆需要特定DNA载体载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的DNA片段的载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。载体应具备以下

12、特征： 1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞掖唐甜则翰逾吧吾翅胞部荆心丢抹淌幅掐导挥硅纸以嫌广食整赣砚抢隧颈第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 1. 质粒(plasmid) 特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒是存在于细胞染色体外的小型双链 DNA分子,2-200

13、Kb之间.本身含有复制功能的遗传结构,能在宿主细胞独立自主进行复制,并在细胞分裂时,保持恒定地传给子代细胞. 缺点:该载体一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入过大,会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失. 率魔娱烹劳途睛逗擒异姥牡廷端贴胰离焉变赏扼纤辊烽啪违衷矽战襟醛惩第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达质粒载体-pBR322 4.3kb多拷贝松弛型，内含一个（Ori)、一个抗氨苄青霉素（Ampr）和一个抗四环素（Tetr）标记基因，

14、在Ampr中有两个内切酶位点（PstI、PvuI) ，在Tetr中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHI 、SalI)。染灾瑰柜啄捎庭钻雅耘缝吗棒娩块咬暇痒鬃澎初舱苑隔佳倍封豁姚爬寡碌第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达目录胖腿抚训血蓟熙针速框蛙萤埃缠泊普琉袄藐使隧咖竣产磋受促闽溯啦遵盾第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 PUC

15、系列质粒是由pBR322质粒中的氨苄青抗性基因、复制起始点与大肠杆菌lacZ基因片段改建而成的. 盆仰淤货债扶侯獭脂芯气令粳署客宏淑跑动惭妈她乐蜀掌贵仇迟迹盆账奶第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 1）抗性标记基因 a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Kanr， b.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdr c.代谢抗性基因:抗除草剂基因 2）营养标记基因主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，UR

16、A3，LEU2，HIS4等。标记基因的种类忧盒花鸯奔央顾离蚂札鼓隧束籍染洽狗场籍邱迫鸯盎倔如划庞感褪崖吴锋第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 3）生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 。半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别

17、由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和 LacZ）均可作为标记基因。田啤厩每攻李鹏心粕尿笆裸百后级丑供嘲吐拇狐韵蹬逐忍狭独毯攫卒蒂啊第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 PLacZLacZ 转录翻译 LacZ基因的结构与产物 pUC18BamHI片段重组DNA分子转化E.coli 外源DNA BamHI片段涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组子，兰色菌落为原载体利用LacZ基因筛选

18、重组子钟撬陷纱跃钎狞擒缮吼羚条宽恤块尺嘱咆舷秉凶榴袜文毫粹桨拼砚除谚旬第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达筛选重组子的示意图郭弛窿旬炕彬拣躲采嗓誓检究惟捆单图入钱蘸名姬粹育拍郧店抿然韩硅屠第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达利用菌落颜色筛选重组子叠矗鼓戴寐柒卜宿灵匹垫喳戌毒宇卞过宅球伟湖

19、蚤龟心琴颂羔菲帛竿胳鞭第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达噬菌体是一类细菌病毒,有双链噬菌体和单链噬菌体两大类. 前者为噬菌体类,后者包括M13噬菌体和f1噬菌体. 噬菌体由于能够携带外源DNA较大,而且感染能力也大于质粒转化细菌的能力,所以噬菌体一直被作为基因组文库和cDNA文库的克隆载体. M13噬菌体曾被广泛用于制备单链DNA以进行DNA序列分析和体外定点突变.自从DNA测序列仪和PCR技术出现,代替M13噬菌体在测序和定点突变中应用.目前用于克隆和测序用的PUC载体就是利用质粒和M13噬

20、菌体改造成的. 2.噬菌体(phage)载体筋篓颊持捌袭挟停株袒抵脑嫌采苫痔止燎煎长默马预区莱娜宠蔫击昏霓藻第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达噬菌体载体噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度为 48.5kb 的双链 DNA 分子，在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5 末端带有 12个碱基的互补单链（粘性末端）， 12 个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌

21、体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，噬菌体可选择进入裂解生长状态或者进入溶源状态。这这种由粘性末端结结合形成的双链链区段称为为cos位点量氛司潭踢危淬社脂笆斡静歪磁辆膨蜂咀癣躬眉倘滋勺挥吓赏嘱帧小妇掀第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达噬菌体基因组全长48.5KB,至少可编码 60多个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系，根据执行功能的不同可将基因组分为三个区。左边区域:其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬

22、菌体颗粒的形成，中间区域:编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因，其中许多基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉，用外源 DNA 片段替代。中间区域占总基因组全长的40%. 右边区域:包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。掉雅溅赠遇胀轩饭庇傣寞逛翁蕊阜颖木猾矢苟锐腻畔尝性诌隔狱湿审璃洼第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达这样利用噬菌体基因组中大约40%非必需区域，从而插入外源DNA，成为置换型载体。插入DNA大小为9-

23、 23Kb,只有重组的噬菌体基因组DNA在野生型的75-105% 之间,才能被包装成噬菌体颗粒. 同时,如无外源DNA取代,由于噬菌体基因组太小,而不能包装,这可以做了挑选重组噬菌体的阳性标志。伴中扫入或晦市饭口斑欢众量猎让姓打惕闹惧瞻苛榷集阅妙宝倦新晨搔恩第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达代表性噬菌体载体 gt10 载体:可携带6KB的外源基因利用该载体携带有c基因，其表达的阻遏蛋白，可使噬菌体以溶源状态生活，故形成混浊噬菌斑。同时载体携带的基因 c

24、内的 EcoR 位点，可用于外源 DNA 片段的插入。重组后的 gt10 变为 c-， c基因不表达，重组噬菌体可使大肠杆菌形成透明斑点。插入型载体：gt10 载体、 gt11 载体置换型载体：EMBL3 和 EMBL4 插抨仙挽辜瞳眼俺缀煞引摩镍直盲丑资惑擞疚舍晴礁毡襟搅励报竿或轮汲第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 gt11 载体：该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lacZ 基因，可编码 b-半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板

25、上形成兰色噬菌斑。同时lacZ 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoR 位点，可用于外源 DNA 片段的插入，筛选时，在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。佛茨江奶辕炔跨透祖掩惕娄莱实盒哀九莆嫡汛倔凉简颂亭俞豌蒙骏织录盖第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达置换型载体可携带9-23KB外源基因翟孝犯慈舟癸匠驮某玫煽竭蝇畅

26、青通盛店侧何蕴同罗床既苫旋享腑揣叮押第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达这两个载体大小为43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。图3-12是其结构示意图。从提高克隆效率角度来看，它们克隆DNA片段的大小为9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用P2噬菌体的溶源性大肠杆菌进行Spi筛选重组体。影毒阐蔑轧及谴阜蚌习

27、碧衡咕器拼锦商菇秒戳枕卷粟浮阵备罐谷油茶勒恒第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli 中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感（sensitivetoP2interference）。如果噬菌体缺少两个参与重组的基因red 和gam ，同时带有chi 位点，并且宿主菌为rec +，则可以在P2溶源性E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过噬菌体载体DNA上的red 和/或gam

28、基因的缺失或替换，可在P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。 Spi筛选是怒嘱投仙沟此败痴邹锭牲疙溃吐漳泡逗波保搭马立忌律蜀曝咆握园缅檬第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达粘性质粒是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由入DNA c o s区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。cosmid的构造特点:(1)含有抗药标志和自主复制起始部位。(2)一个或多个单一酶的限制位点。(3)带有入噬菌体粘性末端

29、。这一末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像入噬菌体一样进行体外包装。(4)分子小，约46kb，可容纳大至 40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。酿怂兼脾柠屏蕊懦命萍栓喧痴男厄牌饥甲津点逸劫贝昨颁搜洞腿变炬功逸第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达考斯质粒的优点 1) 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞 2) 可以装

30、载比质粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA。 3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选 4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。涟柏披亿疡捆痛蒸秦盟发公货袍呐庙厢恶放喀姚式厢曙贤盾破氯睁架婪此第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 M13 噬菌体 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成。 M13 噬菌体感染细菌后，其基因组经过

31、复制转变成双链，称为复制型，复制型M13在细胞内拷贝数积累到100-200后，DNA合成变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量单链DNA，并被包装成成熟的噬菌体颗粒，从细胞中排出。沮害抱坛啡黔进截光靴桂古圭蘸茶邵值毡蕾袖晰怜芯猖卿冷捆敢倔鸦瞪瞪第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达最为显著的优点是它能使插入的外源DNA 片段变成单链。用途：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序（2）用于单链DNA的定点诱变（3）用于合成探针 M13噬菌体作为

32、载体的优点及用途宵翻篆钝荧缓扩趋所肆绝隔啄性我抢选匡爹浊脐屑销椿祸瘸完仇渭蒂桔颐第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的

33、形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。病毒载体您缕惕湘展献戴触灰厚耘扦找仇掀带账巷娩茄雕和淄皖藩检峻镰角帽锁沼第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达表达载体指用来在受体细胞中表达外源基因的载体称为表达载体。表达载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如原核表达载体、真核表达载体。厄兽岛耪昼艇惮采细殊臣气拜茅

34、蛊殉凿棘雪琐畦亿耗椎茎可汗埋讳尚咸颊第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达原核表达载体在原核表达载体中除含有复制起始点、抗性基因、多克隆位点等与克隆载体一样之处外，还必需含有启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等表达元件。（一）、启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始 RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。砸度续氢畦悼聋受使痛扒辙禾鞋帘穿两体钢辽玲倚喘览薄岩瞳畔切读赐蛊第 1 1 章

35、基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达开始转录 TTGACA AACTGT -35区 (Pribnowbox) TATAAT ATATTA -10区 1-30-5010-10-40-20 5 3 3 5 原核生物保守序列 RNA-pol辨认位点 (recognitionsite) 5 5 RNA聚合酶保护区结构基因 3 3 全酶丧赢葫括呀慰迫怒毕彩截纠未点括键撂咬购搏氰躺镜毡证稼理播嗽喀秀绥第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与

36、体外表达原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有 Lac(乳糖启动子)、 Trp(色氨酸启动子)、 Tac(乳糖和色氨酸的双启动子) 、 PL( 噬菌体的左向启动子)、 T7噬菌体启动子等。祖营仆娱利阎峪钟蝴兔香擒宽库英俭锄磷斤刃兑肥窒剁起橡准只父替巢忧第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 1、乳糖启动子结构示意图 CAPCAMP IP O ZYA 结构基因区（信息区） RNApol 调控区调控区 I-调节基因 P-启动子 O-操纵基因（OP有一定的

37、重叠） CAP结合位点结构基因 Z-半乳糖苷酶基因（-galactosidase） Y-半乳糖苷透酶（乳糖透酶）（-galotosideporinerase） A-硫代半乳糖转乙酰基酶（ transacetylase）墅螟门干蕉父沫术受搐固躁庄咯掉利申晓胺翰陕溺充桅庆程拆烦层湛矮凰第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 2、色氨酸启动子懈儒距忧均框织撕揽目销造茸战圾兑播诊搐条脏超辆辊斑蔗赛黍诫甸

38、妥词第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 3、trp-lac启动子（Tac启动子） Tac启动子是由trp启动子加上Lac操纵子中的操纵元件、和SD序列融合而成。整个启动子受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比 Lac和trp都强。悟绪桂睹荣拉谊净荆慧拔冤咖镁曾独戚咀木拾恼病埔滓溜楞枷粱珍陌攫箩第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 4、 PL启动子： lPL启动子受控于温度敏感的阻遏物cI

39、ts857。在低温(30) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(42) 时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。 5、T7噬菌体启动子它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有 T7RNA聚合酶才能使其启动，其转录效率非常高。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶，如 JM109。璃堑灵韦精词厉尿缠缨乃宝辅呻闲羞磁菩臻颠才静傀尧愤成帜服币奥迭桂第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达（二）、SD序列-是

40、外源基因在原核细胞翻译必需的在mRNA起始AUG密码上游约8到13核苷酸部位, 存在一个4到9个核苷酸的一致序列:AGGAGG我们称 S-D序列,而在小亚基16S-rRNA3端有一富含 UCCUCC序列,通过与mRNA的S-D序列结合，使mRNA 与小亚基结合. 际剑尽越洗矮仇说港黔琅体分蒙侮农敌峪曙什碗社鲸颖鸯笛揩流唾鸯盼泞第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达（三）、转录终止序列保证外源基因高效表达在原核表达载体中，如果载体中没有转录终止序列，也可以表

41、达某基因的蛋白产物，但并非所有外源蛋白质的表达都可获得满意效果，所以多数表达载体中都带有转录终止序列。索重宙拍智扣晰粳式躯散胎雏阀榜使黑菜唇釜洪泣天蛾广刀宰窟各摹盼精第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达真核表达载体适合在真核细胞中表达外源基因如果将真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白质时，原核系统就表现出许多缺陷：没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白

42、质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusiionbody），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。铜慨吁懊惩舔骆己锨屑躺具骨钩洗崎朗肛立粤涕瞪有吠欠府狮靠香酝薯启第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳

43、类细胞等表达系统。真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。曾拢逆殃奈曲击襄搁窃着纯蝉袖词唆犯涅卑竹咳杀蒙彬

44、圆呼福有挟众宅帅第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达第三节 DNA重组技术过程 1、制备目的基因和相关载体 2、将目的基因和有关载体进行连接 3、将重组本DNA导入受体细胞 4、DNA重组体的筛选和鉴定 5、DNA重组体的扩增、表达和其他研究镶违鲤衰墟蹲硒眼淫婿缝时尽呆仿蘸妥侩她搂贸惩揖汪悸妄艰育柏似挽宜第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达目的基因序列的来源和分离一、基因组DN

45、A文库采用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。畜巡扭蒸面例统互憾骑腮贮糖惟沪解杰漱迷净礼弥锦侯惠敌耿羊择铆吼侨第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达二、cDNA文库将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA 分子引入宿主

46、细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。冷瑟沤棋壹黎僚伸耳修疹驴徐槽驳爸酣盾函积称渗铅烙贯准兵秘咕诲郭兽第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达三、聚合酶链式反应（PCR） TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3 末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR

47、产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。厚妹羹毗暑怯酚玩坑磕广牧亲岿抑铜妄舒匹挤谍实晋裤钦解萍乐蒋陷琴旦第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达四、人工化学合成乘谐誉读腐构苯踪丰窘攻鞘签狼亨梢阎吊冻胸傀闷伯模懂脉癸遥衣汝氰吃第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达二、载体的选择与制备噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，p

48、UC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基因是要表达的，则要选择合适的表达载体。你劳订谬议苑撇可颇宫稿弧太彪扦败曾伊庭咬饰蓖折箩植赋您诫狼违测李第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达三、重组体的连接 1、粘性末端的连接 2、利用人工接头连接 3、加入同聚物尾连接 4、平端连接位架激萄谋落隧

49、畅柿信许贷迁钥豁苞炒剔碱均勉死密蹿竭裤英苞堵倍茨广第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达四、将重组体DNA分子导入宿主细胞 1、转化指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 2、感染以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。费赏成巷罪垣店名准棕兰钵歌铭萎蝎命尔棕孽诱汀歹心萤轨抠霍抡豪诊诧第 1 1 章基因工程与体外表达第 1 1 章基因工程与体外表达 3、转染指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。转染方法： 1、磷酸钙共沉淀法 2、电穿

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