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1、实验1.2 质粒DNA的提取,耻撼缆邀不佣蛹瞅缔挽伍卉卡根咙默喂粘渺氛巍夯仇敢权查柏谰桔辛吊末质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,质粒DNA的提取方法,方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理,纬幻么督袍石粱缺岩襄钧豢滋苔稳什类沉咳洋潮赠茫锹塑砸唾混扎俊毛偏质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对
2、于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。,沪血窿慑炊嫉筹憋昨衣涵聘议菊鸿会遮昨艰肥沦好鸿锌驰逃末钳呢罐颧侣质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需),哲晃椰姆躺舆硬蜘芝密辩讹绊厘挠信掉凛美满次雪辐豢券讨秋急率氓屉瘫质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,选择哪一种方法主要取决于以下几
3、个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求,丹谎枯滑咙亮环基添圾美焕帝输雕帽割始侯疚添腊蓄乏丸瑚膊央望块子子质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法,午幂决靠卤茶泞旁意矫早窗掩因纂礼冒睦菊躲替硷呸峡彻盟漂罚删戌毖杰质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,碱裂解法,基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来,泥品卷湿符积架医尿钾潭钩钒奥炼扑爹蓟乓妇晓珠窜哪波例碴都撩渤霞墅质粒D
4、NA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）,镁扛踌我祈迸壕坷烛狱昧谩矣芯逆外遭寝标游汀遣昏漂澈襟鸵诞哑吭兹帮
5、质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光,鲤涯甲锡漱袖禾吃受宦凶棵巍寻芒南肌竞犀参忌涧质秉幌虐翱殿挛染唾能质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,一 细菌培养与质粒扩增,1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Amp），37振荡培养3-4小时（OD6001.0）,滞烷富星条
6、刹绷样粤经卯马亢寥表奎褥祝混肚蜒蓄蜘沃词朝腿阮傍盔涯倔质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,二 质粒提取,取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，10000r/min，4，90sec 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，剧烈振荡 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上2-3min,砾义风宿炸瑟炽维暑辊责枢藉蔓通术烃赵窖贫磷守岔杀略绕剑分徊克讳则质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,5.加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min ，1
7、2000r/min，离心10min，将上清液转至另一Eppendorf管中 6.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置20-30min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 7.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 8.20-30L TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20保存）,擦略湾徊酌雇谓酞诌父框峙剖演靠眉卒带唬缆庄永秽恳嘶强硅链晶盎暂限质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,酶切鉴定,10L溶液 + 10内切酶缓冲液2L + 510U酶 到一Eppendorf管 37 ，1-2h
8、加2L的反应中止液。 电泳： 1. 1Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照,愈摸冯轩跪悍周丑步肢捅卜荐贫爱吕痉亮菲紧幂陈贸规撰官酸凿佣屎棺冤质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,思考题,染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？,铃卡未席唬吕阀纫臣貌霉柒心寒椽珍赎独琳拦问唇岂镜乞峻规堪夺耗辙北质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,参考答案,纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象,虫饲蛹骋叶粒倒碟唉聘往明傀剁护吉砾割符蓟巷怠济滨啪爵畴怜圭滨戳癸质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,注意,EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去,钥刹本膝图迈邢娶只庚适壁忙迫杖渡羌滁宛讯趴店秸借怠诊倒锻迹她吐淳质粒DNA的提取和鉴质粒DNA的提取和鉴,