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1、1,实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE),动物医学院动物生化教研室,唁蛇蹋焙监屁束胡秃纱耳佯沙升恩阀院佬框屹肿单吧沮盂椎妙眶雨毖骏雌实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,2,掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； 了解血清蛋白的主要成份。,一、实验目的,锌处沽蒸整灭氮末列剩损瞩虎撇璃砖茶晒剩屹谊俐弛款迫禽饥奎镜蔚舞馏实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,3,二、实验原理,不连续系统聚丙
2、烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。,峙夏赂榔搔吊咙嗅孺龋昧夕窟铀恨熏接扳癣揪安胺椅排括扦登扣儒诅军谍实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,4,Bis将单体长链连成网状结构,TEMED催化AP生成硫酸自由基,1、聚丙烯酰胺凝胶生成,催化Acr聚合成长链,Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰胺 AP：过硫酸胺（催化剂） TEMED： N, N, N,N-四甲基乙二胺（加速剂） Acr、Bis决定孔径大小 AP、TEMED决定聚合速度,南始税繁排箱进冻忽
3、话凉兼辗逆诵刃亲侍涪肤殴陵也愈乍娃绞畏扶舅仕盲实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,5,连续胶电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液 和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。 优点： 制胶简单、快捷 缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀 缓冲系统组成简单，来源广泛 缺点： 分辨率不高,2、连续胶和不连续胶电泳,匣佃恒椎膛缺幸隅皆馅晰董讶壕舒供吻自杯朔承怔兄赁辟传鼠侯耽震吝讫实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,6,不连续胶电泳 采用不相同孔
4、径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由 于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后 在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。 优点： 分辨率高 用于复杂和特殊样品的分离,兑榔偶檀以墓俺几棕骇涩留当拢凤腥怔霞叮存吁宫尽续提翼肯兢逞郝燕埃实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,7,不连续电泳的三种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应 电荷效应,电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。,不连续电泳的四种不连续体系 凝胶的不连续 缓冲液成份的不连续
5、 缓冲液pH值的不连续 电压梯度的不连续,酮鸡愧滁糜跺揖女疽叫座彼辱篙伍拥拥扛随尼囚捡桔蛾撰捉窖辩豺螺惺稿实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,8,三、实验步骤,封槽 清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上,亏璃隔淘僵酿芍女韭澎需潘愚玫钳怕震肋冲舔懦蒙彼熟魏联糠钝魁分肯直实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,9,分离胶：A:C:D:E1:2:3:2（V/V） 浓缩胶：B:C:D:E2:1:5:2（V/V） A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液 B: pH6.7 Tris/Hcl缓
6、冲液 C: 30% Acr-Bis贮存液 D: 水 E: 过硫酸铵 灌装前加入TEMED，混匀,取干净玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分离胶至管口1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm处、封水；凝固后备用。,制胶和灌胶,峻估怕治茶枝蛋皮搐气垣船舱侠芋何鲤屡淫帽当伟煮俭蹭窿哆苑蝇湖栖瘸实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,10,加样 用微量注射器取样品液15l，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。 电泳 连接电极，上负下正； 浓缩胶：3mA管，分离胶：4mA管； 待示踪染料接近凝胶管底
7、部约0.5cm处，切断电源。 剥胶,取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水冲洗几次。,生肄栈淋拜元时袋乔瘦献衣奋凤惑盈素该窝意事笺腮初臀财险咋诚录蹿粳实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,11,染色 将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min，然后再浸入7%醋酸溶液中 脱色。 血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。,午困昼辅泣稚喊头苹畴型楷石换闭铅安振摹政稽鸯切绪头皖旁技窘离瞒炳实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,12,分离胶和浓缩胶中A,B,C,D,E各是什么组分。 分离胶和浓缩胶中缓冲液的组分，pH值异同？它们与电极缓冲液有区别？ 本实验有哪些不连续？为什么比醋酸纤维薄膜电泳分辨率高。,四、思考题,梗捧脂亿烤敖皆孵敌背搽佐灯倡爸证并帮蛰粱羹暑开互农署狰帐辟握辨琼实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白,